老鹳草多糖提取工艺的优化及治疗类风湿性关节炎的药效学研究

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目的:老鹳草是中国传统的类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)治疗药物,且植物多糖具有抗炎和免疫调节作用。由于老鹳草多糖(Geranium wilfordii Maxim polysaccharide,GWP)提取率较低,目前关于GWP的研究几乎没有,因此有必要研发一种提高GWP提取率的方法,为GWP的结构鉴定和药效学研究提供基础。本研究对GWP进行了提取工艺优化、多糖的分离纯化和初步的结构鉴定等研究,并从肠道菌群以及Th17/Treg细胞分化角度初步探讨了GWP在RA中的作用,为GWP的研发提供了实验研究基础。方法:1.利用超声辅助提取法提取GWP,通过单因素法以及响应面分析法优化提取工艺,并与传统热水浸提法进行比较。2.分离纯化GWP,并对其结构进行初步分析。3.采用灌胃(Intragastric administration,i.g.)给药法,检测小鼠肠道菌群变化及其代谢产物短链脂肪酸(Short-chain fatty acids,SCFAs)的含量,研究GWP对胶原诱导性关节炎(Collagen-induced arthritis,CIA)小鼠肠道菌群及其代谢物的影响。4.研究i.g.和腹腔注射(Intraperitoneal injection,i.p.)的GWP对Th17/Treg细胞平衡的影响。结果:1.最佳的GWP提取工艺为:超声时间为78 min,液料比为40:1 m L/g,超声温度为68°C,超声功率为300 W,提取率为4.50±0.14%,与预测的提取率4.43%相近,且远高于传统的热水浸提法的提取率2.58±0.35%。2.GWP分离纯化后得到三个组分GWP-0.1、GWP-0.3和GWP-0.4,重均分子量(Weight-average molecular weight,Mw)分别为8063 Da、9841 Da和987 Da。GWP-0.1的单糖组成甘露糖(Mannose,Man)、葡萄糖(Glucose,Glc)、半乳糖(Galactose,Gal);GWP-0.3的单糖组成为鼠李糖(Rhamnose,Rha)、Gal、岩藻糖(Fucose,Fuc)、Glc、木糖(Xylose,Xyl)、Man以及Ara;而GWP-0.4的单糖组成为Rha、Xyl、Man、Glc、Gal。3.经i.g.治疗后小鼠的体重有明显的回升,脾脏有明显的减小,而后足也有明显的消肿,同时GWP改善了失调的CIA小鼠的肠道菌群,调节了肠道菌群的丰度,调节了厚壁菌门/拟杆菌门(Firmicutes/Bacteroidetes,F/B)比例,增加了肠道菌群代谢产物SCFAs(乙酸、丙酸、正丁酸等)的含量并使Th17/Treg细胞比例趋向平衡。4.CIA小鼠的体重经纯化多糖在i.p.治疗后有明显的增加,脾脏重量也在治疗后减小趋向正常,而后足也有明显的消肿,且相较于CIA组小鼠Th17和Treg的细胞失衡,治疗后的小鼠Th17/Treg细胞趋向于平衡。结论超声辅助提取法可以有效的提高GWP的提取率,GWP通过i.g.能够改善CIA小鼠的肠道菌群丰度并增加SCFAs的代谢量,缓解CIA小鼠炎症。且GWP纯化后,经i.p.可被吸收而对CIA小鼠起到治疗作用。
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