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背景:牙周炎是一类以牙龈炎症和牙槽骨吸收为主要特征的慢性炎症性疾病。然而,现有的治疗方法如牙周基础治疗、引导组织再生术等,均不能满足病人和口腔医生对牙周炎治疗的期待。二甲双胍(Metformin,MET)是临床II型糖尿病首选的口服降糖药物。近年来的研究发现二甲双胍除了降血糖作用外,在多囊卵巢综合征、肿瘤、心血管疾病、非酒精性脂肪肝、衰老和青春期早熟等诸多方面显示出显著疗效。有文献显示,这些作用与二甲双胍的抗炎作用相关。然而,二甲双胍对于牙周炎的作用尚不清楚。高迁移率族蛋白(High Mobility Group Protein,HMG)属于非组DNA结合蛋白,广泛分布于高等真核生物的细胞核内,包括HMGA,HMGB,HMGBN三个亚群;HMGB亚群中进一步分为HMGB1,HMGB2,HMGB3。其中,HMGB1的含量最多,因在进化过程中其序列高度保守,几乎存在于所有的真核细胞中,同源性高达99%,是唯一能够被释放到细胞外发挥其胞外生物学活性的蛋白质。人类的HMGB1基因位于13号染色体长臂上的1区2带,其相对分子量为25 KD,普遍分布于机体的各项器官,除在肝、脑组织中主要存在于胞浆外,在大多数组织中存在于胞核。在正常生理情况下,HMGB1在细胞核内与DNA的结合是松散的,但当细胞受到机械损伤或坏死的时候,HMGB1易于从受损的细胞核内释放到细胞外,继而诱发炎症反应。由于HMGB1在炎症性疾病的发病机制中发挥重要作用,因此亦被认为是机体坏死细胞发出的内源性危险信号。目的:体内实验中利用丝线(Ligature)结扎建立动物实验性牙周炎模型,在体外实验中建立脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导人牙周膜细胞(h PDLCs)炎症模型。观察Met对实验性牙周炎的作用,初步探索其作用机制。同时观察在炎症刺激和Met的作用下HMGB1的表达及作用。方法:1、Met对小鼠牙周炎模型骨吸收情况的影响:用6-0丝线置于小鼠上颌第一、第二磨牙牙间隙9天,建立实验性牙周炎模型,同时200mg/kg Met灌胃处理14天每天1次,14天后处死小鼠。采用Micro-CT观察小鼠上颌第一第二磨牙牙槽骨吸收水平;在上颌第一磨牙根分叉处测量骨体积分数(BV/TV),骨小梁厚度(Tb.Th);计算釉牙骨质界至牙槽骨嵴顶(cementoenamel junction to the alveolar bone crest,CEJ-ABC)的距离,监测牙槽骨的吸收。2、Met对小鼠牙周炎模型炎症因子的影响:将小鼠上颌骨脱钙、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片后,H&E染色观察其牙槽骨炎症细胞浸润水平;IL-6、IL-8免疫组化观察Met对小鼠实验性牙周炎的抗炎作用;HMGB1免疫组化检测其在炎症和Met共同作用下的表达和定位。3、LPS体外诱导h PDLCs炎症模型:分别用0μM,0.5μM,1μM,5μM,10μM,20μM的LPS处理h PDLCs,采用细胞计数kit-8(CCK-8)检测细胞活力;采用real-time PCR(RT-PCR)和酶联免疫吸附法(ELISA)检测炎症细胞因子IL-6、IL-8的表达,以筛选出未明显抑制h PDLCs活性且炎症因子明显升高的的最适LPS浓度。4、HMGB1在h PDLCs炎症模型的表达和定位:用上述相同浓度的LPS处理h PDLCs后,采用real-time RT-PCR和ELISA检测h PDLCs在不同浓度LPS作用下HMGB1的表达及细胞外的释放量;Western blot测定HMGB1在细胞内的定位。5、Met对h PDLCs炎症模型的影响:分别用0μM,50μM,100μM,150μM,200μM的Met处理h PDLCs,采用细胞计数kit-8(CCK-8)检测细胞活力;h PDLCs经过不同浓度Met预处理24h,再加入最适浓度的LPS处理24h后,进行RT-PCR和ELISA检测,检测IL-6、IL-8炎性因子表达量变化。6、HMGB1和AMPK/NF-?B通路在Met抗h PDLCs牙周炎症模型中的机制研究:用上述相同浓度的Met和LPS处理h PDLCs后,real-time RT-PCR和ELISA检测HMGB1的基因表达变化及胞外的释放量;核内和核外Western blot测定HMGB1在细胞内的定位;免疫荧光法明确HMGB1细胞内定位。通过Western blot实验来检测AMPK/NF-?B相关蛋白的表达。结果:1、Met灌胃处理丝线诱导牙周炎模型,Micro-CT观察到牙槽骨吸收水平明显减少,骨小梁骨量和厚度明显增加,CEJ-ABC距离显著变小。2、取小鼠上颌骨脱钙、包埋、切片免疫组化染色后,Met+Ligature组IL-26、IL-8的表达减少,HMGB1在胞外和胞质的表达量减少,在核内表达增加。3、建立LPS诱导h PDLCs炎症模型。LPS处理h PDLCs后细胞活力略有减少。当LPS浓度大于1μM时炎症细胞因子(IL-6、IL-8)的表达明显增加,且与LPS浓度呈剂量依赖方式增长。4、LPS处理于h PDLCs后,RT-PCR、ELISA、Western blot结果显示LPS可促进HMGB1的表达、核向质转运和释放。5、Met处理h PDLCs 24h后细胞无抑制作用。200μM的Met预处理LPS诱导h PDLCs炎症模型后,促炎因子IL-6、IL-8的表达减少,上清液中含量降低。6、Met预处理LPS诱导h PDLCs炎症模型后,RT-PCR、ELISA、Western blot、免疫荧光结果显示Met可以逆转炎症作用HMGB1高表达、抑制核向质转运和阻止胞外释放。Met对HMGB1的作用可能与AMPK/NF-?B有关。结论:综上所述,Met可以通过抑制HMGB1的表达、移位和释放来缓解牙周炎,并且Met对HMGB1的作用可能通过激活AMPK/NF-?B通路。因为牙周炎的预后取决于良好的炎症控制,本实验为二甲双胍对牙周炎的治疗作用提供了新的数据支撑,并且为临床治疗牙周炎提供了新思路,HMGB1可能是一个潜在的干预目标牙周炎的靶点。