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不同种群的恒河猴(Macacamulatta)MHC(majorhistocompatibilitycomplex)基因的差异性,很大程度上影响了用其作为动物模型的实验研究结果的稳定性、可靠性和可重复性。因此清晰的了解云南地区恒河猴种群免疫遗传学背景对于运用该种群开展各项研究是非常重要的。
恒河猴MHCⅠ类基因Mamu(MacacamulattaMHCgene)-A目前已有大量报道证明它与很多疾病的易感性和发病进程相关。Mamu-A*01位点阳性就被公认与猴免疫缺陷病毒(SIV)的感染与延缓病程相联系。另外A﹡02、A﹡04也有报道证实这两个位点同样与SIV感染后的病程发展有关;Mamu-Ⅱ类基因在很多疾病尤其是病毒感染中也起了非常重要的作用,部分位点被证明也与SIV感染后的病程发展有关。
针对目前研究热点的恒河猴MHC基因MamuⅠ类基因及Ⅱ类基因部分位点,采用序列特异性引物一聚合酶链式反应分型方法(PCR-SSP),对云南地区的140只恒河猴(其中92只来源于云南景东野外自然繁殖群、48只来源于本灵长类中心自繁群)的MamuⅠ类基因Mamu-A﹡01至A﹡06这6个等位基因,和MamuⅡ类基因Mamu-DRB区的Mamu-DRBI*0303、0305/06、0309、0403、1005/07:DRB3*0403;DRB5*0301/02;DRB6*0101、0103、0104/05这10个等位基因进行检测。统计结果显示MamuⅠ类基因Mamu-A﹡01至A﹡06位点结果为阴性;所检测的MamuⅡ类基因Mamu-DRB区10个等位基因阳性率分别为,野外群DRB1*0305/06位点34.8%;DRB1*0309位点41.3%;DRB1*0403位点27.2%:DRB3*0403位点40.2%;DRB6*0101位点40.2%;DRB6*0103位点95.7%。自繁群DRB1*0305/06位点45.8%;DRB1*0309位点58.3%;DRB1*0403位点22.9%;DRB3*0403位点66.7%;DRB6*0101位点54.2%;DRB6*0103位点62.5%,其余位点结果为阴性。与国内其他地区及印度猴群比较发现,云南地区的猴群携带的MHC基因有所不同。另外比较云南地区的野外群与自繁群的MHC基因情况发现,这两个群体间并未出现基因多态性的显著差别。
为进一步验证检测出的各位点各等位基因扩增产物的正确性,选取Ⅱ类基因Mamu-DRB区的Mamu-DRB1*0305/06、0309位点进行了部分测序并结合单链构象多态性分析(SSCP)的方法进行深入分析。发现抽取的三个Mamu-DRB1*0305/06位点阳性样本测序结果中2个与GenBank参考序列完全相同,另一个检测出5个碱基的突变;随机抽取的2个Mamu-DRB1*0309位点阳性样本测序结果都与GenBank参考序列完全相同。SSCP检测结果显示有大于80%的阳性样本与测序样本相同,即含同一等位基因,引物针对本次实验研究种群特异性较好。初步证明用SSCP方法进行准确性控制是可行的。
直接测序和SSCP两种方法的结合使用,能够在避免大规模测序的同时较好的保证检测结果的正确性,大大节约研究成本