调控Smad核转录共抑制因子(SnoN)的分子机制与肾纤维化关系的研究

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目的:Smad核转录共抑制因子(SnoN)作为一种拮抗剂可严格调控转化生长因子-β1/smad(TGF-β1/Smad)信号的活性,从而保证在正常的生理条件下TGF-β1/Smad信号输出的稳定性。既往的研究表明在单侧输尿管梗阻术(UUO)后所致的纤维性肾病中SnoN蛋白表达进行性下降;而肝细胞生长因子(HGF)则可通过诱导肾小管上皮细胞特异性表达SnoN从而拮抗TGF-β1的致纤维化作用。但是目前引起SnoN表达变化的调控机制不明。因此本研究探讨了在梗阻性肾病中SnoN表达下调的分子机制以及HGF引起细胞特异性SnoN表达上调的分子机制。Smad泛素化调节因子-2(Smurf2)是一种E3泛素链接酶,可通过选择性介导Smad信号途径中关键组分的降解从而在TGF-β信号活性的调节中起枢纽作用。由于TGF-β信号活性亢进在纤维性肾病的发生和发展中起关键作用,因此,在本研究中我们还探讨了Smurf2在纤维性肾病中表达的调节、其靶蛋白的特异性以及其表达上调的生物学意义。方法:(1)采用结扎雄性CD-1小鼠左侧输尿管的方法建立UUO动物模型,并设假手术小鼠为正常对照组。应用蛋白印迹、Northern印迹和RT-PCR技术,检测肾组织中SnoN mRNA和蛋白表达水平的变化;并借助蛋白降解和泛素化活性的体外检测方法,观察在梗阻性肾病中SnoN蛋白降解率和泛素化活性的变化;并采用免疫组织化学和免疫沉淀技术观察Smurf2的表达以及与SnoN之间的相互作用,初步探讨在梗阻性肾病中SnoN表达变化的分子机制;(2)在人的近曲小管上皮细胞(HKC)中,运用蛋白印迹、RT-PCR、质粒转染、免疫荧光和RNA干扰等技术进一步探讨了TGF-β1引起SnoN表达水平变化的分子机制以及SnoN对TGF-β1致纤维化反应的影响作用;(3)采用HKC细胞为体外观察系统,应用各种特异的化学抑制剂,通过蛋白印迹、RT-PCR等方法探讨HGF诱导SnoN表达上调的细胞内信号转导途径;进一步应用染色质免疫沉淀、质粒转染等技术从基因水平观察HGF诱导SnoN表达上调的分子机制;(4)采用UUO的方法建立肾小管-间质病变动物模型,并给予外源性HGF处理,通过蛋白印迹、免疫组织化学和免疫荧光染色方法从体内进一步探讨HGF诱导SnoN表达上调的分子机制;(5)采用各种原因所致肾病患者的肾活检组织标本,应用免疫组织化学染色的方法检测在纤维性肾病中Smurf2表达水平的变化;(6)在HKC细胞中,利用RT-PCR、蛋白印迹等方法探讨了TGF-β1对于Smurf2表达的影响及其作用机制;(7)采用质粒共转染和蛋白印迹分析技术,进一步探讨了Smurf2对于TGF-β1/Smad信号转导途径中各组分表达的影响;同时以质粒转染、荧光素酶活性检测和蛋白印迹分析等技术观察过度表达Smurf2对于TGF-β1诱导的基因转录和纤维化反应的影响。结果:(1)与假手术组相比,UUO术后7天小鼠肾组织中SnoN蛋白表达水平明显降低而其mRNA水平保持相对稳定,并且SnoN的泛素化活性和蛋白酶体依赖性的蛋白降解率明显增加;此外,在梗阻性肾病中Smurf2表达增加,并与SnoN形成复合物。(2)在HKC细胞中,TGF-β1可诱导SnoN蛋白经泛素-蛋白酶体依赖性途径降解;尽管SnoN可与另一个Smad转录共抑制因子Ski形成复合物,且在TGF-β1刺激下,它们可分别与Smad2/3形成三元络合物,但异位表达Ski并不能影响SnoN的降解率;而且以蛋白酶体抑制剂阻断SnoN的降解或采用RNA干扰技术下调Smurf2的表达来增加SnoN蛋白表达水平可阻断TGF-β1诱导的基因转录、α-平滑肌肌动蛋白和纤维结合素的表达,提示SnoN的降解是TGF-β1施加其致纤维化反应的必要条件。(3)在HKC细胞中,HGF诱导的SnoN表达上调发生在基因转录水平,且是由Erk-1/2信号途径介导的;HGF可快速激活Erk-1/2信号途径上、下游的信号分子,然后引起核内cAMP反应元件(CRE)结合蛋白(CREB)的活化;染色质免疫沉淀分析结果显示,HGF可促使CREB和Sp1结合到其在SnoN基因启动子区中的相关位点上;此外,蛋白印迹分析结果表明HGF仅在HKC细胞中诱导CREB的活化,而在系膜细胞和成纤维细胞中无此作用;而且质粒转染和特异性化学抑制剂作用的实验结果也表明CREB的活性和Sp1是启动HGF诱导的细胞特异性SnoN表达上调的必要因素。(4)体内实验结果也表明:在梗阻性肾病中,给予外源性的HGF基因可诱导肾组织内Erk-1/2的磷酸化、CREB的活化以及SnoN表达上调。(5)免疫组织化学染色结果显示在各种原因所致肾病患者的肾小管中Smurf2表达明显增加;而在HKC细胞中过度表达SnoN抑制Smad信号活性可完全阻断TGF-β1诱导的Smurf2表达上调。(6)质粒共转染实验结果提示在基础状态下,过度表达Smurf2可促进Smad2及其核转录共抑制因子——SnoN、Ski和TGIF蛋白表达下调,这主要是通过蛋白酶体依赖性蛋白降解的增强而引起的;荧光素酶活性检测等结果也证实了过度表达Smurf2可增强TGF-β1诱导的基因转录、E-上皮细胞钙粘蛋白表达下调及纤维结合素表达上调。(7)质粒转染结果表明过度表达Smad2和Smad3可促进TGF-β1诱导的纤维结合素表达上调;反之,用siRNA技术抑制Smad2和Smad3的表达可阻断TFG-β1所致的纤维结合素表达上调。因此,提示在肾小管上皮细胞中Smad2和Smad3是TGF-β1诱导的纤维结合素表达上调的必要条件。结论:(1)在梗阻性肾病中,SnoN表达水平的下调主要是通过泛素-蛋白酶体依赖性蛋白降解的增强来实现的。(2)CREB活化和Sp1一起触发HGF诱导的肾小管上皮细胞特异性SnoN表达上调。(3)虽然在纤维性肾病肾小管中Smurf2表达特异性上调,而且体外实验结果也表明TGF-β1可通过Smad信号途径介导Smurf2表达上调,但由于在肾小管上皮细胞中Smurf2既可引起TGF-β1/Smad信号阳性调节因子的降解,又可引起TGF-β1/Smad信号抑制因子的降解,从而使TGF-β信号得到复杂且精细地调节。因此,提示Smurf2功能的失调可能导致纤维性肾病发病机制中TGF-β/Smad信号活性的失调。
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