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从鼎湖山采集的千余株菌株中采用对峙培养的方法筛选荔枝霜疫霉的拮抗菌,共得到15个有拮抗活性的菌株。将15个菌株经过固体发酵和液体发酵后,对其发酵物的甲醇提取物进行活性测定,最终筛选得到全部活性良好的5个菌株,即SC0155、SC0581、SC0642、SC0924和SC1169。选择其中的师岗链轮丝菌SC1169作进一步的研究。
对师岗链轮丝菌SC1169固体发酵的菌丝体用95%的乙醇浸提三次,乙醇提取物依次用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取分部。对分部提取物进行抗菌活性测定,对有拮抗荔枝霜疫霉活性的三氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇部分的提取物进行分离纯化。经过硅胶柱层析、凝胶柱层析和制备HPLC等分离方法,从三氯甲烷部分获得7个化合物(1-7),从乙酸乙酯部分获得6个化合物(8-13),从正丁醇部分获得2个化合物(14-15)。
运用现代光谱(UV、ESI-MS、HRTOFMS、1D NMR、2D NMR)技术鉴定了从师岗链轮丝菌SC1169固体发酵的菌丝体中分离得到的15个化合物。其中,化合物2、6、8和12为新化合物,分别命名为5,8-二甲氧基萘-2-甲酰胺(5,8-Dimethoxynaphthalene-2-carboxamide,2)、3,10,10-三甲基腺嘌呤(3,10,10-Trimethyladenine,6)、链轮丝菌素(Streptoverticilin,8)、链轮丝菌酮(Streptoverticilinone,12)。化合物5和13为首次发现的天然产物,分别是3,4-二甲氧基肉桂酰胺(3,4-Dimethoxycinnamamide,5)和4,6-二乙酰氨基间苯二酚(4,6-Diacetylanunoresorcinol,13)。其余分别鉴定为2-苯乙酰胺(2-Phenylacetamide,1)、4-甲氧基苯甲酰胺(4-Methoxybenzamide,3)、3,4-二甲氧基苯甲酰胺(3,4-Dimethoxybenzamide,4)、β-胡萝卜甙(β-Daucosterol,7)、环(S-脯氨酸-R-亮氨酸)[Cyclo-(S-Pro-R-Leu),9]、环(R-亮氨酸-R-异亮氨酸)[Cyclo-(R-Isoleu-R-Leu),10]与环(R-缬氨酸-R-亮氨酸)[Cyclo-(R-Val-R-Leu),11]、L-缬氨酸(L-Valine,14)、L-酪氨酸(L-Tyrosine,15)。
采用管碟法检测化合物拮抗荔枝霜疫霉的活性。实验结果显示,化合物8的抗菌活性较好,最小抑菌浓度(MIC)达到了250μg·ml-1,同阳性对照多菌灵相当。化合物2和12拮抗荔枝霜疫霉的活性较弱,其MIC为1000μg·ml-1。化合物1、4、5、9和13的抗菌活性很弱,其MIC仅为2000μg·ml-1。其他的化合物则无抑制荔枝霜疫霉菌丝生长的活性。
采用咸水虾(Artemia salina)致死试验检测化合物的毒性。结果显示,化合物5表现出较弱的毒性,其半数致死浓度LD50为263.03μg.ml-1。化合物2、4的毒性很弱,在浓度剂量最大(1000μg·ml-1)时,其校正死亡率都没有超过50%。化合物9、12、13对咸水虾没有任何毒性。
本研究从鼎湖山1000余株真菌和放线菌中筛选获得了15株荔枝霜疫霉菌的拮抗菌,从其中的师岗链轮丝菌固体发酵物中分离获得了15个化合物,其中4个(2、6、8和12)为新化合物。在抗荔枝霜疫霉菌活性试验中,化合物8显示有良好活性,化合物2和12有微弱活性。研究结果进一步说明从自然界中寻找植物病原菌的拮抗菌、研究拮抗菌的拮抗机制和抗菌活性物质是有效利用微生物资源和发现新抗菌活性化合物的有效途径。