血友病B(Hemophilia B,HB)是X连锁单基因缺陷疾病,由于FⅨ基因的突变导致凝血因子IX(Factor IX,FⅨ)的缺陷,或者生成无活性FⅨ。FⅨ是一种凝血因子,在发生凝血反应时,被活化的FⅨ可以将凝血酶原激活成为凝血酶发挥凝血功能。目前,临床上使用药物替代疗法,将FⅨ蛋白直接注射到患者血液中,以维持体内的凝血功能,但是这种治疗手段成本高,治疗时间长,需要持续用药。干细胞移植是目前正在发展的有效治疗手段,通过对患者体内提取出来的干细胞进行体外基因纠正,再回输到患者体内,让其在患者体内表达活性FⅨ,从而达到治疗效果。间充质干细胞(Mesenchymal stem cell,MSC)也是干细胞来源,它遍布于人体每个器官组织,具有多向分化潜能,是细胞治疗的良好细胞载体,因此本研究使用人源MSC作为治疗细胞,探究LV-FⅨ在MSC中的表达情况。本研究首先构建LV-EF1α-FⅨ,用于探究MSC表达外源FⅨ的情况。表达检测结果表示,启动子EF1α可以在两种人源MSCs(FT902和1207-9)中高效启动表达FⅨ,并分泌到胞外表现出一定的凝血功能。FⅨ的蛋白修饰检测表明,由MSC表达的FⅨ蛋白具备良好的糖基化修饰,但是γ-羧基化修饰水平较低,且对FⅨ活性影响较大。经分析表明可能是EF1α高表达FⅨ导致超过了MSC的γ-羧基化能力造成的。因此本研究在第二阶段设计了两种内皮组织特异性启动子VEC和KDR来调控FⅨ表达。通过替换FⅨ基因序列前的启动子序列构建了内皮特异性LVs:LV-VEC-FⅨ和LV-KDR-FⅨ,通过转染了FT902和1207-9进行表达检测,FⅨ ELISA结果显示LV-EF1a-FⅨ,LV-VEC-FⅨ和LV-KDR-FⅨ的表达量分别为1300?1500 ng/10~6/24h,200?500 ng/10~6/24h和500?800 ng/10~6/24h。FⅨ的活性结果也体现了同样的趋势,相对正常人血清活性的值分别为~10%、~2%和~5%。同时还发现,VEC和KDR启动子的表达调控降低了FⅨ的表达量,提高了FⅨ平均γ-羧基化水平,降低了Vitamin K的依赖性。VEC和KDR启动子的应用提高了FⅨ在MSC中表达的稳定性,避免无活性FⅨ引起的副作用,同时通过靶向内皮组织表达也降低了引起免疫反应的风险,为MSC介导的细胞移植治疗B型血友病提供数据支持。