论文部分内容阅读
1.研究背景腹主动脉瘤（Abdominal aortic aneurysm,AAA）是一种慢性炎症性血管疾病,在65岁以上男性中较常见,患者常以剧烈胸痛为首发症状于急诊科就诊。主动脉瘤一旦破裂,具有较高的死亡率。在组织学上,AAA的特征是炎症细胞浸润于血管外膜和中层、细胞外基质破坏和新生血管形成。目前,人们对AAA的发病机制仍然知之甚少,手术是该疾病唯一广泛使用的疗法,因此急需开发针对AAA的新型药物。越来越多的证据表明,调节炎症相关基因的表达是延缓AAA进展的有效策略。聚二磷酸腺苷核糖聚合酶 1（poly（ADP-ribose）polymerase,PARP-1）是一种核酶,在DNA受损后被激活并促进DNA修复。大量研究表明PARP-1在炎症性疾病中被激活,例如心肌再灌注损伤、中风和休克等,抑制PARP-1的表达可以减轻炎症相关反应。然而,抑制PARP-1能否减轻血管紧张素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ）诱导的AAA形成及其机制尚有待研究。基于上述知识,我们假设在AAA血管炎性病变中PARP-1被诱导激活,抑制PARP-1可能会通过抑制炎症反应以减缓AAA形成。因此,我们试图探索抑制PARP-1对Ang Ⅱ诱导的AAA的治疗作用及其可能机制。2.目的:（1）验证小鼠AAA组织中的PARP-1表达及活性是否增加;（2）探讨抑制PARP-1是否可以减轻AAA的形成及严重程度;（3）阐明抑制PARP-1减轻AAA的病理学机制。3.方法:3.1实验动物（1）动物品系野生型C57BL/6J小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司。ApoP-和PARP-1-/-小鼠由北京维通利华实验动物技术有限公司协助构建,ApoE-/-PARP-1-/-小鼠由ApoE-/-和PARP-1-/-小鼠杂交繁殖,动物的护理和实验程序符合“保护和使用实验动物指南”。在本研究中,所有的实验均经山东大学齐鲁医院伦理委员会批准。（2）实验动物分组随机选取6～8周龄的小鼠,将其分为四组:ApoE-/-小鼠输注PBS（control）组、ApoE-/-小鼠输注 Ang Ⅱ（AngⅡ）组、ApoE-/-PARP-1-/-小鼠输注 PBS（PARP-1-/-）组,ApoE-/-PARP-1-/-小鼠输注 Ang Ⅱ（AngⅡ+PARP-1-/-）组。3.2 AAA模型的构建预先将适当剂量的PBS或AngⅡ灌注于微量渗透泵中,分别埋入6～8周龄雄性ApoE-/-小鼠或ApoE-/-PARP-1-/-小鼠背部皮下,以速度为1000 ng/kg/min持续泵入28天。观察各组小鼠28天的存活率,AAA的形成率及瘤体直径,取样后将部分组织于固定液中固定,或液氮淬冷后保存于-80℃冰箱用于后续实验。3.3 RNA的提取、反转录及实时荧光定量PCR（qRT-PCR）提取上述四组小鼠腹主动脉组织或腹主动脉瘤的RNA,利用反转录试剂盒将mRNA反转录为cDNA后,通过qRT-PCR检测目的基因Ct值,利用β-actin作为内参,采用2-ΔΔCT计算目的基因相对表达量。3.4 Western blotting 分析提取上述四组小鼠腹主动脉组织或腹主动脉瘤的蛋白,BCA测定蛋白浓度后进行SDS-PAGE凝胶电泳,检测小鼠PARP-1的蛋白表达。3.5组织学检测及免疫组织化学检测将固定在4%多聚甲醛的组织经脱水包埋制成蜡块后,制备4 μm的石蜡切片,苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining,H＆E）分析组织的形态,Masson染色检测组织胶原蛋白含量,免疫组化分析血管平滑肌细胞的成分及炎症细胞的浸润。3.6细胞的培养人主动脉内皮细胞（human aortic endothelial cells,HAECs）在内皮细胞培养基（endothelial cell medium,ECM）内加入 10%胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL链霉素后培养。人主动脉血管平滑肌细胞（aortic vascular smooth muscle cells,VSMCs）在加入 10%FBS、100 IU/mL 青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM中培养。所有细胞的培养是在含有5%CO2的37℃培养箱中进行。HAECs和VSMCs均购于ATCC。3.7 二氢乙锭染色（dihydroethidium staining,DHE）在体外,将HAECs分为3组:PBS对照组,Ang Ⅱ刺激组,Ang Ⅱ+PARP-1 siRNA组。向各组加入5μM DHE,37℃避光孵育30 min,然后用不含FBS的ECM洗涤3次。使用荧光显微镜检测HAECs中活性氧（reactive oxygen species,ROS）的产生。3.8 Transwell 实验在体外,将VSMCs分为3组:PBS对照组,Ang Ⅱ刺激组,Ang Ⅱ+PARP-1 siRNA组,取100 μL各组VSMCs悬液加入Transwell小室;下室中加入600 μL无血清培养基,24 h后取出Transwell小室,弃去孔中的培养基,用不含钙的PBS洗2遍,甲醇固定30 min,0.1%结晶紫染色20 min;PBS清洗3遍后,显微镜下随机拍摄五个视野观察细胞并计数。3.9 EdU染色实验将control组、Ang Ⅱ组及Ang Ⅱ+siRNA-PARP-1组的细胞接种于预先放入无菌小圆玻片的12孔板中,待细胞贴壁后,向每孔加入EdU溶液。经细胞固定液固定,0.1%Triton X-100处理后,向每个载玻片中加入200 μL Click-iT反应混合物,室温避光孵育30 min,细胞核用DAPI染色;共聚焦显微镜下拍照观察,结果用ImageJ软件分析。3.10细胞Annexin-V/PI凋亡实验在体外将VSMCs分为3组:PBS对照组,Ang Ⅱ刺激组,Ang Ⅱ+PARP-1 siRNA组。取各组VSMCs悬液,每管样品加入1μLAnnexin V-APC染料,混匀后37℃放置20min,每管加入1μL PI染色2 min后,流式检测。3.11数据统计及分析方法以上所有实验结果均由三次或者三次以上的独立重复试验获得,利用统计学软件Graphpad Prism 8进行数据统计及图形绘制。Kaplan-Meier生存曲线观察各组之间的生存率,并选用Log-Rank法进行比较分析。首先采用Shapiro-Wilk检验对数据分布进行正态性假设检验。对于正态分布的单因素数据,两组数据之间采用未配对的Student-t检验分析;三组及三组以上数据采用单因素方差分析（ANOVA）检验进行分析,然后多组之间采用Newman-Keuls 比较检验分析。对于不属于正态分布的数据,采用非参数Kruskal-Wallis H检验非参数统计进行分析。P＜0.05被认为有显著性差异。4.结果:4.1小鼠AAA组织中的PARP-1表达及活性增加利用Ang Ⅱ输注建立AAA模型后,与PBS输注组相比,Ang Ⅱ诱导的小鼠AAA组织中PARP-1 mRNA与蛋白的表达明显升高,活性明显增强。4.2敲除PARP-1降低小鼠AAA的形成率与死亡率与PBS输注组相比,AngⅡ输注成功诱导ApoE-/-小鼠AAA形成。与AngⅡ组相比,Ang Ⅱ+PARP-1-/-组小鼠AAA的形成率下降,因主动脉破裂而导致的死亡率降低。4.3 PARP-1敲除降低AAA的直径与厚度与control组相比,Ang Ⅱ输注显著增加主动脉直径和壁厚;而与Ang Ⅱ组小鼠相比,Ang Ⅱ+PARP-1-/-组小鼠AAA的瘤体直径与壁厚均明显降低。4.4 PARP-1敲除减少血管内炎症细胞的浸润与control组相比,Ang Ⅱ刺激后主动脉内皮内的单核细胞和巨噬细胞含量均明显增加;与AngⅡ组相比,Ang Ⅱ+PARP-1-/-组小鼠血管内单核细胞与巨噬细胞的浸润数量明显减少。4.5 PARP-1敲除增加血管内的平滑肌细胞成分与control组相比,Ang Ⅱ刺激后平滑肌细胞的标志物α-SM actin表达明显降低,与Ang Ⅱ组相比,PARP-1敲除可增加α-SM actin的表达。4.6 PARP-1敲除增加血管内的胶原纤维与control组相比,Ang Ⅱ刺激后胶原纤维含量明显减少;与Ang Ⅱ组相比,PARP-1敲除增加血管内胶原纤维的表达。4.7抑制HAECs中PARP-1的表达可减轻Ang Ⅱ诱导的氧化应激在HAECs中,Ang Ⅱ诱导细胞发生氧化应激和DNA损伤,抑制PARP-1表达后,细胞的氧化应激和DNA损伤减轻。4.8降低VSMCs中PARP-1的表达减少其迁移、增殖和凋亡在VSMCs中,Ang Ⅱ促进细胞迁移、增殖和凋亡,而PARP-1敲除改善细胞的迁移、增殖和凋亡。5.结论（1）小鼠AAA组织中的PARP-1表达及活性较正常腹主动脉明显增加;（2）PARP-1敲除可以降低小鼠AAA的形成率与死亡率,改善AAA的直径与厚度;（3）PARP-1敲除可以增加血管中平滑肌细胞与血管胶原纤维的含量,减少巨噬细胞的浸润;（4）抑制PARP-1的表达可减轻HAECs中Ang Ⅱ诱导的氧化应激;（5）抑制PARP-1的表达可以降低VSMCs迁移、增殖和凋亡。总之,抑制PARP-1表达可能是治疗AAA的可行策略。1.研究背景脓毒症（sepsis）是由于宿主对感染的反应失调而导致的全身炎症反应综合征,发病率呈逐年增长。脓毒症时血管内皮细胞向促凋亡、促炎、促粘连和促凝血表型转移,释放细胞因子、趋化因子和促凝因子等,导致对蛋白质和液体的通透性增加,引起间质渗漏。因此,研究导致脓毒症所致血管内皮功能障碍的激活途径是限制脓毒症所致器官衰竭的有效途径。瑞芬太尼（Remifentanil）是一种有效的μ-片受体激动剂,研究证明瑞芬太尼在多种炎症疾病中发挥保护作用,如急性肺损伤、缺血/再灌注损伤和兴奋性毒性脑损伤。然而,瑞芬太尼在脓毒症中的潜在作用和机制尚未得到充分研究。已有研究证明,瑞芬太尼可以抑制缺氧/复氧诱导的细胞释放炎性因子及氧化应激反应,在以上研究中我们已经证明抑制PARP-1可以抑制细胞的氧化应激反应,因此在本研究中,我们旨在探究瑞芬太尼是否可以通过调控PARP-1的表达在脓毒症中发挥保护作用,以及其发挥保护作用的潜在机制。2.目的（1）探究在人主动脉内皮细胞（human aortic endothelial cells,HAECs）中,瑞芬太尼对脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的炎症反应是否具有抑制作用;（2）探究在HAECs中,瑞芬太尼是否可以降低LPS诱导的PARP-1的表达和活性;（3）探究在HAECs中,瑞芬太尼是否可以通过抑制PARP-1/NF-κB信号通路减轻LPS诱导的炎症反应。3.方法3.1细胞系及细胞的处理HAECs在内皮细胞培养基（endothelial cell medium,ECM）内加10%胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）、100 IU/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素中培养。培养条件为含有5%CO2的37℃培养箱。将HAECs以105/孔的密度接种于24孔板中,将其分为三组:对照组、LPS+PBS组和LPS+瑞芬太尼组。用等体积PBS或2.5 μM瑞芬太尼预处理HAECs 30 min,然后用10 μg/mL LPS刺激24 h后。收取细胞,用于后续实验。3.2 二氢乙锭（dihydroethidium staining,DHE）染色将HAECs分为三组:对照组、LPS+PBS组和LPS+瑞芬太尼组。按照DHE说明书测量各组HAECs中的O2-量,细胞在5 μM DHE中37℃避光孵育30 min,然后用不含FBS的ECM洗涤3次。使用荧光荧光显微镜在53 nm处获得。3.3 彗星试验（comet assay）检测DNA损伤按照彗星测定试剂盒说明书进行操作,通过荧光显微镜观察彗尾长度,然后使用CaspLab Comet Assay软件对每组细胞进行分析。3.4 RNA的提取、反转录及实时荧光定量PCR（qRT-PCR）提取上述三组HAECs的RNA,利用反转录试剂盒将mRNA反转录为cDNA后,通过qRT-PCR检测目的基因的Ct值,利用β-actin作为内参,采用2-ΔΔCT计算目的基因iNOS、ICAM-1和PARP-1等基因的相对表达量。3.5 Western blotting 分析提取上述三组HAECs的蛋白质,BCA测定蛋白浓度后进行SDS-PAGE凝胶电泳,检测小鼠 PARP-1 的 iNOS、ICAM-1、PARP-1、PAR 及 NF-κB p65 等蛋白的表达。,3.6免疫荧光将HAECs在预冷的4%多聚甲醛中固定30 min;使用0.1%Triton X-100打孔10 min;5%BSA封闭后与NF-κB p65在4℃下孵育过夜;然后使用DyLight 488标记的荧光二抗孵育;细胞核用DAPI染色;在Nikon共聚焦显微镜下拍照观察。结果用ImageJ软件分析。3.7数据统计与分析数据表示为平均值±标准差（mean±SD）,Graphpad 8.0用于数据统计分析。以上所有的实验结果均由三次或者三次以上的独立重复试验获得,首先采用Shapiro-Wilk检验对数据分布进行正态性假设检验。对于正态分布的单因素数据,两组数据之间采用未配对的Student-t检验分析;三组及三组以上数据采用单因素方差分析（ANOVA）检验进行分析,然后多组之间采用Newman-Keuls 比较检验分析。对于不属于正态分布的数据,采用非参数Kruskal-Wallis H检验非参数统计进行分析。P＜0.05被认为有显著性差异。4.结果:4.1瑞芬太尼减少HAECs中LPS诱导的超氧化物阴离子产生与Control对照组相比,LPS刺激会增加HAECs中超氧化物阴离子的产生,瑞芬太尼预处理则显著降低超氧化物阴离子的产生。4.2瑞芬太尼减轻HAECs中LPS诱导的DNA损伤与Control对照组尾部很少有DNA相比,LPS显著增加了 HAECs中尾部的DNA含量,而与LPS组相比,瑞芬太尼预处理显著降低了 HAECs中尾部的DNA含量。4.3瑞芬太尼降低HAECs中LPS诱导的iNOS和ICAM-1表达qRT-PCR与Western blotting结果显示,与Control对照组相比,LPS刺激显著增加了 HAECs中iNOS和ICAM-1 mRNA与蛋白表达;与LPS组相比,瑞芬太尼预处理显著降低了 LPS诱导的HAECs中iNOS和ICAM-1 mRNA与蛋白的表达。4.4瑞芬太尼降低HAECs中LPS诱导的PARP-1的表达和活性qRT-PCR及Western blotting结果显示:与Control相比,LPS刺激显著增加了 HAECs中PARP-1 mRNA和蛋白质表达,并显著提高了 PARP-1的活性形式PAR的表达,而与LPS组相比,瑞芬太尼可降低HAECs中LPS诱导的PARP-1 mRNA和蛋白质表达,并显著降低了 PARP-1活性形式PAR的表达。4.5瑞芬太尼抑制LPS诱导的NF-κB p65核易位和表达免疫荧光结果表明NF-κB p65在LPS刺激前主要位于HAECs的细胞质中,经LPS刺激后,NF-κB p65主要定位于细胞核内,而在瑞芬太尼预处理组,LPS刺激后p65仍主要保持在细胞质中。此外,Western blotting结果显示与正常对照组相比,LPS可以显著增加NF-κB p65的表达,而PARP-1 siRNA或瑞芬太尼可以降低LPS诱导的NF-κB p65的表达。5.结论（1）瑞芬太尼可以降低HAECs中LPS诱导的超氧化物阴离子产生及DNA损伤;（2）瑞芬太尼可以降低HAECs中LPS诱导的PARP-1表达及活性升高;（3）瑞芬太尼可以通过抑制PARP-1/NF-κB信号通路减轻HAECs中LPS诱导的炎症反应。1研究背景血管内皮细胞糖萼（glycocalyx）是位于内皮细胞顶膜的一层绒毛状多糖蛋白复合结构,介于管壁与血液之间,是内皮细胞表面的动态天然屏障。严重脓毒症患者内皮细胞糖萼显著变薄。糖萼的降解也被认为是脓毒症中微循环功能障碍的原因之一。以上研究结果提示抑制PARP-1表达对脓毒症血管内皮细胞起保护作用,PJ34是一种PARP-1新的特异性抑制剂,盲肠结扎穿孔（cecal ligation and puncture,CLP）是脓毒症经典的动物模型,在本部分研究中,我们将建立CLP诱导的脓毒症模型,在前期研究基础之上继续探讨抑制PARP-1表达能否作用于内皮细胞的糖萼部分,从而对脓毒症血管内皮细胞起保护作用。2目的（1）验证抑制PARP-1表达对CLP诱导的脓毒症小鼠具有保护作用;（2）验证抑制PARP-1表达可以降低脓毒症小鼠血液中炎症因子的释放;（3）明确CLP诱导的脓毒症模型中,主动脉血管内皮细胞的糖萼脱落;（4）明确抑制PARP-1能否通过调控血管内皮细胞的糖萼对脓毒症小鼠起保护作用。3方法3.1实验动物与分组野生型雄性6～8周龄C57BL/6J小鼠,购于北京维通利华实验动物技术有限责任公司。将实验小鼠随机分为四组:正常对照组（Control组）、PJ34组、Control+CLP组和PJ34+CLP组。其中,PJ34组与PJ34+CLP组在建立模型前,预先腹腔注射25 mg/kg PJ34,连续注射3天。Control组与Control+CLP组在建立模型前,预先腹腔注射等体积DMSO,连续注射3天。3.2 CLP模型的构建在Control+CLP组和PJ34+CLP组,麻醉小鼠后,对其胸腹部消毒;使用无菌剪刀在小鼠腹壁剪一切口,经切口进腹在回盲瓣远端分离并用丝线结扎1/3处盲肠;注射器针头于结肠端结扎穿孔,并挤出少许粪便,间断缝合腹膜及皮肤。在Control组与PJ34组,只行腹部切口,不行盲肠结扎穿孔术。观察各组小鼠生存率,获取小鼠的血液及主动脉组织用于后续实验。3.3 ELISA检测血清中炎症因子的表达根据ELISA试剂盒说明书进行操作,检测小鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α的表达。3.4 ELISA检测血浆中糖萼的成分根据ELISA试剂盒说明书进行操作,检测小鼠血清中Syndecan-1、硫酸乙酰肝素酶和透明质酸的表达。3.5数据统计与分析以上所有的实验结果均由三次或者三次以上的独立重复试验获得,利用统计学软件Graphpad Prism 8进行数据统计及图形绘制。Kaplan-Meier生存曲线观察各组之间的生存率,并选用Log-Rank法进行比较分析。首先采用Shapiro-Wilk检验对数据分布进行正态性假设检验。对于正态分布的单因素数据,两组数据之间采用未配对的Student-t检验分析;三组及三组以上数据采用单因素方差分析（ANOVA）检验进行分析,然后多组之间采用Newman-Keuls 比较检验分析。对于不属于正态分布的数据,采用非参数Kruskal-Wallis H检验非参数统计进行分析。P＜0.05被认为有显著性差异。4结果4.1抑制PARP-1表达提高CLP小鼠的生存率构建CLP诱导的脓毒症模型后,小鼠的死亡率明显高于正常对照组,与Control+CLP组相比,PJ34+CLP组小鼠的生存率明显提高。4.2抑制PARP-1表达降低CLP小鼠血清中炎性因子的表达构建CLP诱导的脓毒症模型后,小鼠血清中炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α的表达明显高于Control组。与Control+CLP组相比,PJ34+CLP组小鼠的血清中炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α的表达明显降低。4.3抑制PARP-1表达对CLP诱导的sepsis小鼠血管内皮糖萼的保护作用构建CLP诱导的脓毒症模型后,小鼠血清中脱落的Syndecan-1、硫酸乙酰肝素酶和透明质酸的含量明显增多,与Control+CLP组相比,PJ34+CLP组小鼠的血清中Syndecan-1、硫酸乙酰肝素酶和透明质酸的表达均明显降低。5结论（1）抑制PARP-1表达可以降低CLP脓毒症小鼠的死亡率。（2）抑制PARP-1表达可以降低脓毒症小鼠血液中炎症因子的释放。（3）CLP脓毒症小鼠主动脉血管内皮细胞的糖萼严重脱落。（4）抑制PARP-1表达可以减轻CLP脓毒症小鼠主动脉血管内皮细胞的糖萼脱落。