金属硫蛋白（metallothioneins，MTs）是一类低分子量、高巯基含量，且能大量结合重金属离子的蛋白质。MTs具有抗氧化、抗肿瘤、解毒及免疫调节等生理功能。因此，寻找开发MTs的资源引起了科学家的兴趣。研究发现微藻细胞内存在类金属硫蛋白，且含量可随重金属诱导明显提高。基于此，本文通过锌诱导小球藻，对小球藻细胞内的类金属硫蛋白进行提取分离和结构表征研究，并且对小球藻类金属硫蛋白的抗氧化及抗菌活性等功能进行试验。本学位论文由六章组成。第一章，较系统地介绍了金属硫蛋白的结构、生理功能与检测方法，对小球藻的生理活性物质提取、开发及应用情况进行总结。第二章，在优化小球藻培养条件的基础上，考察重金属对小球藻生物量及金属结合蛋白诱导量的影响。经优化，小球藻的培养液组成为：以灭菌海水为基础，加入1.0g/LNaHCO₃、0.8g/L KNO₃、0.02g/L KH₂PO₄、0.6mg/L V_B1和2μg/L V_B12。此时，小球藻的生物量可达4×10⁷cfu/mL。待小球藻培养至对数生长期中期，分别加入5、10、20、40、60和80μmol/L的重金属（CdCl₂、ZnCl₂、CuSO₄·5H₂O）进行胁迫培养，考察重金属对小球藻生物量和金属结合蛋白诱导量的影响。结果表明，在低浓度条件下，小球藻生物量和金属结合蛋白诱导量均随重金属离子(Cd²⁺、Zn²⁺、Cu²⁺)浓度的升高而增加，当Cd²⁺、Zn²⁺和Cu²⁺的浓度分别为40μmol/L、20μmol/L和5μmol/L时，生物量达到最大；当Cd²⁺、Zn2+和Cu²⁺的浓度分别为60μmol/L、60μmol/L和40μmol/L时，金属结合蛋白诱导量达到最大。第三章，小球藻经60μmol/L的Zn²⁺胁迫培养5天，然后离心收集藻泥，经超声波细胞破碎后，离心得到上清液即蛋白质粗提液。粗提液经葡聚糖凝胶层析柱G-75及脱盐柱G-25分离、纯化，经真空冷冻干燥即获得小球藻锌结合蛋白。经分析，未脱盐的小球藻锌结合蛋白的纯度为62.4%，脱盐后纯度为99.5%。试验测定了小球藻锌结合蛋白在不同pH值下的紫外吸收光谱。结果表明，小球藻锌结合蛋白的紫外光谱特征与兔肝金属硫蛋白（Zn-MTs）的十分相似，故将其命名为类金属硫蛋白（Zn-MT-like）。此外，用Tricine-SDS-PAGE法测定该蛋白质的分子量约为8.2kDa。经测算，每克鲜藻可诱导Zn-MT-like蛋白达2mg以上。第四章，用不同方法对小球藻类金属硫蛋白的结构进行表征研究。DEAE SephadexA-25的阴离子交换层析分离的结果表明，小球藻类金属硫蛋白出现两个锌信号峰，其中第二个峰与兔肝MTs-2的洗脱时间相同，而第一个峰稍前于MTs-1被洗脱。在pH2.0时，经C18反相柱（2.1i.d.×250mm，5μm）分离并与电喷雾电离质谱联用分析，发现该蛋白有三个强的信号峰，经推算这三个色谱峰组分的分子量分别为6222.3Da、6162.5Da和6132.2Da。从氨基酸组成的分析结果可知，小球藻Zn-MT-like蛋白由78个氨基酸组成，其中半胱氨酸含量可达15.4%，并含有苯丙氨酸等芳香族氨基酸和组氨酸。此外，经电感耦合等离子质谱测得每分子Zn-MT-like蛋白可结合2个锌离子。第五章，对小球藻类金属硫蛋白的抗氧化及抗菌活性进行研究。结果表明，小球藻Zn-MT-like蛋白清除羟自由基、DPPH自由基和超氧阴离子自由基的半数抑制率浓度（IC50）分别为13.12mg/L、2.23mg/L和48.59mg/L，其清除能力高于兔肝Zn-MTs和谷胱苷肽。采用琼脂糖孔穴扩散法，对小球藻Zn-MT-like蛋白的抗菌活性进行试验研究，发现小球藻Zn-MT-like蛋白对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌）和霉菌（青霉、曲霉）具有显著的抗菌活性，1mg/mL的Zn-MT-like蛋白对金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、青霉和曲霉的抑菌圈直径分别为13.2mm、17.4mm、7.2mm和9.8mm，而对大肠杆菌、酵母菌则无抗菌活性。此外，试验发现在酸性条件下，小球藻Zn-MT-like蛋白的结合金属易解离出来，形成脱金属硫蛋白（apo-MT-like）。而在中性介质中，apo-MT-like蛋白能重新与Cu2+或Se（Ⅳ）结合，形成铜或硒结合的类金属硫蛋白。