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超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，EC 1.15.1.1，简称SOD）是一种金属酶，在生物体内分布极广，是目前为止已知的二千多种酶中研究报道最多的酶。由于金属辅基的不同，它可分为四类，分别为Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD和Ni-SOD。SOD是一种重要的氧自由基清除剂，能催化超氧阴离子（O2-. ）的歧化反应，而且它的存在可能与机体衰老、肿瘤发生、自身免疫性疾病和辐射防护等有关，故有广阔的开发及应用前景。本文综述了SOD的种类、分布、化学结构、理化性质、活性与含量的测定方法。本实验是称取500 g新鲜茶花粉，按1∶2(W/V)加入pH 7.8，25 mmol/L磷酸钾缓冲液(PBK)，加石英砂少许，冰浴中研磨成浆，于-70 ℃冰箱反复冻融三次；4 ℃，10 000ｒ/min离心20 min，去沉淀和上层脂类物质，中层清液为SOD粗提液。0 ℃缓慢加入固体硫酸铵到粗提液中，至饱和度为35 %。4 ℃放置过夜，4 000ｒ/min离心20 min，收集上清液。在上清液中继续缓慢加入固体硫酸铵至饱和度为55 %，4 ℃放置过夜；离心弃上清，沉淀用PBK溶解透析72 h获得粗酶液。将粗酶液上到已用PBK平衡好的DEAE-52离子交换柱（3.0×35 cm），用分别含0.1 mol/L、0.2 mol/L、0.3 mol/L及0.5 mol/L NaCl的PBK进行分段洗脱，收集酶活力峰。透析除盐，冻干后用蒸馏水溶解，上Sephadex G-100分子筛层析柱（1.0×100 cm），用PBK洗脱，收集酶活力峰。将获得酶液冻干后用1.5 mol/L (NH4)2SO4溶解后上已用1.5 mol/L (NH4)2SO4平衡过的Phenyl SepharoseTM 6 Fast Flow疏水层析柱（1.5×15 cm），分别用0.75 mol/L (NH4)2SO4、0.1 mol/L (NH4)2SO4及蒸馏水进行分段洗脱，收集酶活力峰获得纯酶。共获得13943 U的纯酶，酶比活为4034.4 U/mg。将Phenyl SepharoseTM 6 Fast Flow纯化获得的SOD经透析、冻干后，进行等电聚焦电泳。纯化的SOD经等电聚焦电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）均显示一条蛋白带，表明纯化的SOD蛋白质是均一的。最后纯化倍数为81.8倍，活性回收率为27.6 ％。采用Folin酚法测定蛋白浓度，以牛血清白蛋白为标准蛋白。SOD活力<WP=63>测定采用邻苯三酚自氧化法。酶活力单位定义为：25 ℃，在325 nm波长处，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50 %所需酶量定义为一个酶活力单位。SDS-PAGE用考马斯亮蓝R 250进行染色，活性染色采用0.2 ％氮蓝四唑-0.01 ％核黄素光还原法。Cu/Zn-SOD对氰化物和过氧化氢均敏感，Mn-SOD对氰化物和过氧化氢均不敏感；而Fe-SOD对氰化物不敏感，对过氧化氢敏感。5 mmol/L的KCN抑制茶花花粉纯化的SOD活力达99 ％，5 mmol/L的H2O2完全抑制该酶的活力，根据不同类型SOD对不同抑制剂的敏感性不同判断其为Cu/Zn-SOD。利用凝胶的分子筛效应把物质按分子大小不同进行分离，采用Sephadex G-100凝胶过滤层析法测得其分子量为70.0 kD。采用的标准蛋白分别为核糖核酸酶A (13,700 Da)、胰凝乳蛋白酶原A (25,000 Da)、卵清蛋白(43,000 Da)、牛血清白蛋白(67,000 Da)、蓝葡聚糖 2000。经SDS-PAGE也测得其分子量为69.5 kD，亚基分子量为34.7 kD，是由相同亚基组成的二聚体。等电聚焦电泳：采用浓度为7 %的聚丙烯酰胺凝胶电泳，1 %的载体两性电解质（pH梯度为3.5-10）。该酶在等电聚焦电泳中呈现一条酶蛋白带，其等电点为4.1。SOD分子稳定性实验：研究了pH、温度、化学试剂和金属离子对SOD活性的影响。结果表明，该酶的热稳定性比一般酶强，最适温度为25 ℃，最适pH为5.5，在pH 11以上迅速失活。由5 ％的EDTA对酶完全抑制，可判断金属离子在酶的活性中心起到关键作用。1 ％SDS、0.5 ％β巯基乙醇可使酶的亚基的解聚，导致酶活丧失。4 mol/L 尿素对酶的影响不大，与文献报道一致。这些结果进一步确定该酶为Cu/Zn-SOD。称取SOD纯品10 mg，用5.7 mol/L HCl于110℃ 水解24 h，用835-50氨基酸自动分析仪进行测定。同其它来源的SOD进行比较发现该酶具有显著特点：富含Trp、Phe、Tyr。二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）法测得其N-末端氨基酸为Gly。SOD的圆二色谱分析：用JASCO J 810圆二色谱仪进行测定，蛋白浓度为43.2 μg/ml。SOD的α螺旋度用圆二色谱222 nm处的椭圆率值以单值法进行计算，测得该蛋白的α螺旋含量为21.8 ％。 <WP=64>用760 CRT型双光束紫外可见分光光度计进行全波长扫描，发现该酶的特征吸收峰在274 nm处。大多数SOD因不含有Trp，其特征吸收峰一般在258 nm左右，而花粉SOD紫外特征吸收峰红移至274 nm，推测可能与花粉SOD的Trp含量相关。而由于酸水解后蛋白质的Trp完全被破坏，因此Trp的含量进行单独测定。发现花粉SOD含有大量的Trp，而其它生物的SOD几乎不含Trp。由于花粉SOD与其它生物的SOD在Trp数量上的巨大差异，使得花粉SOD的荧光光谱成为其特征光谱。荧光光谱用770 CRT荧光分光光度计测定，激发波长为295 nm，激发波长狭峰宽度为2 nm，发射波长狭峰宽度为5 nm，测定波长范围为320-375 nm。用N-溴代琥珀亚胺（NBS）对SOD分子中的色氨酸残基进行了化学修饰，发现每个SOD分子有21个Trp残基，其中7个位于分子表面。Trp的发射荧光光谱的最大荧光强度在335 nm，NBS修饰花粉SOD后其修饰酶的荧光强度?