【摘 要】
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水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarfvirus,RBSDV)引起的玉米粗缩病是危害我国玉米生产的一种主要病害。RBSDV是呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)的成员,目前关于其与玉米寄主的分子互作报道较少。本文以RBSDV副核心蛋白P8为诱饵筛选玉米茎叶cDNA文库,获得与之互作的寄主因子ZmAKINβγ蛋白,研究了 P8与ZmAKI
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水稻黑条矮缩病毒(Rice black streaked dwarfvirus,RBSDV)引起的玉米粗缩病是危害我国玉米生产的一种主要病害。RBSDV是呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)的成员,目前关于其与玉米寄主的分子互作报道较少。本文以RBSDV副核心蛋白P8为诱饵筛选玉米茎叶cDNA文库,获得与之互作的寄主因子ZmAKINβγ蛋白,研究了 P8与ZmAKINβγ蛋白的相互作用以及ZmAKINβγ与RBSDV之间的相互影响,初步探索了 ZmAKINβγ在RBSDV侵染玉米过程中的功能以及ZmAKINβγ影响病毒侵染所参与的生理路径。利用酵母双杂交(yeast-two hybrid,Y2H)和双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)实验证明了 P8与ZmAKINβy-2以及玉米中ZmAKINβγ基因另一拷贝编码蛋白ZmAKINβy-1在酵母、本生烟和玉米原生质体细胞中的互作。P8与AKINβγ蛋白的互作不具有寄主特异性,而是依赖于ZmAKINβγ蛋白N端的KIS(kinase interacting sequence)和第一个CBS(cystathionine β-synthase)保守结构域。对P8与ZmAKINβy-1/-2蛋白的亚细胞定位研究表明,P8与ZmAKINβy-1/-2均定位于本生烟细胞和玉米原生质体细胞的细胞质与细胞核中,且P8可在核仁中聚集,ZmAKINβy-1/-2与P8共表达使P8无法聚集于核仁中。而P8的表达会抑制ZmAKINβγ-1/-2作为γ亚基参与snf4Δ酵母突变体细胞糖代谢途径的功能。RBSDV侵染后不同时间点差异调控ZmAKINβγ-1/-2基因的表达。基因枪轰击介导的瞬时表达实验表明RBSDV侵染改变ZmAKINβγ-1/-2在玉米叶片中的亚细胞定位。为解析ZmAKINβγ-1/-2基因的生理功能及其在RBSDV侵染过程中的作用,用雀麦花叶病毒(Brome mosaic virus,BMV)VIGS系统同时沉默ZmAKINβγ-1/-2基因,结果显示,ZmAKINβγ-1/-2的沉默会影响蔗糖和淀粉代谢途径中多个基因的表达,并提高葡萄糖和蔗糖的积累量。同时,沉默ZwAKINβγ-1/-2基因后的RBSDV挑战接种实验表明ZmAKINβγ1/-2基因的下调表达会促进RBSDV的积累,进一步发现外施葡萄糖促进RBSDV的积累。RBSDV侵染调控糖代谢途径相关基因的表达,上调葡萄糖的含量而下调蔗糖的含量。ZmAKINβγ-2以及水稻和本生烟编码的AKINβγ同源物均可诱导本生烟细胞坏死反应,但P8的表达并不影响ZmAKINβγ-2诱导细胞坏死的活性。ZmAKINβγ除可响应RBSDV的侵染,甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)或玉米褪绿斑驳病毒(Maize chlorotic mottle virus,MCMV)的侵染均可调控ZmAKINβγ基因的表达,说明ZmAKINβγ基因可响应不同类型病毒的侵染。本论文的研究表明ZmAKINβγ作为普遍响应病毒侵染的寄主蛋白,在RBSDV侵染玉米过程中与P8蛋白直接互作并参与抵抗RBSDV的侵染;本文明确了 ZmAKINβγ可以参与玉米糖代谢调控,并且糖代谢路径在RBSDV与玉米互作过程中发挥重要作用。本研究有助于揭示玉米寄主抵御RBSDV侵染的抗病机制,对于玉米抗粗缩病基因的挖掘和抗病玉米种质的创制可能具有重要的参考价值。
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