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龙胆酸（2，5-二羟基苯甲酸）途径是芳烃化合物代谢中重要的开环途径之一。龙胆酸开环生成顺丁烯二酸单酰丙酮酸(MP)，该物质有两种代谢方式:在异构酶作用下发生异构生成反丁烯二酸单酰丙酮酸，再进一步水解成反丁烯二酸和丙酮酸，从而进入三羧酸循环;或在水解酶作用下直接发生水解反应生成顺丁烯二酸和丙酮酸。前者在多种菌属中曾有报道，但后者只在假单胞菌属中有报道，且其水解途径至今仍未研究透彻。以3，5-二甲酚筛选到的Pseudomonas putidaNCIMB9869是唯一被报道含有两条完整龙胆酸代谢途径的菌株，却无任何功能基因和分子水平的报道。同时，在水解途径中顺丁烯二酸代谢生成的D-苹果酸为手性化合物，可作为许多光学活性化合物合成的前体，具有潜在的应用价值。 本研究结合生长实验以及紫外分光光度计、高效液相色谱(HPLC)检测，基本确定9869菌株中存在两条龙胆酸代谢途径，且该菌株已丧失代谢甲基酚类物质的能力。紫外可见分光光度计检测MP代谢，随着反应进行，吸收峰从330向340nm偏移，说明异构途径存在，且实验证明其依赖于还原型谷胱甘肽;加入N-乙基马来酰亚胺(NEM)抑制异构途径时，吸收峰在330nm处下降，说明水解途径存在。HPLC结果证明代谢产物中存在反丁烯二酸和丙酮酸，而顺丁烯二酸未被检测到。 9869菌株可以顺丁烯二酸为基质生长，敲除D-苹果酸脱氢酶的编码基因可能将其构建为一株利用龙胆酸代谢合成D-苹果酸的工程菌。为此，通过基因组步移、生物信息学分析等手段获得了xlgA基因，并首次表达、纯化和鉴定了D-苹果酸脱氢酶XlgA，其单亚基分子量为40kDa，催化反应时以NAD+为氢受体，而不能以NADP+为氢受体。XlgA可催化D-苹果酸反应，但不能催化L-苹果酸、L-酒石酸、D-柠苹酸反应。XlgA的表达受底物影响，以顺丁烯二酸、D-苹果酸为基质生长时，xlgA的转录被诱导，而以L-苹果酸或3-羟基苯甲酸为基质生长时，则只有本底水平的表达。