镁作为一种二价阳离子,在细胞中含量丰富。在体内参与几百种酶反应,包括所有需要腺苷酸环化酶的过程,如ATP,Na+/K+-ATP酶,和磷脂酶C。耳蜗的神经化学和神经药理学方面变化的复杂性,如果镁缺乏,其对内耳细胞功能,微循环和活性氧的形成等方面造成的影响是严重的;另外细胞外镁离子是天然生理性钙离子通道阻滞剂。而在缺血、缺氧及噪声等损害因素的作用下,在内耳传入神经突触间隙表现为兴奋性神经递质的堆积,过量的谷氨酸过度激活NMDA受体,钙离子通道病理性开放,引起大量钙离子内流,过多的钙激活细胞内一系列的级联反应,如氧自由基的增多,细胞膜的通透性增加等等从而引起细胞受到损伤。如果增加镁,是否可以改善这些病理变化呢?本课题通过细胞培养和噪声性聋大鼠为研究对象,探讨在损害因素作用下镁对内耳的保护性机制,以期为将来感音神经性聋的治疗提供一些新的策略。本文分四部分。第一部分螺旋神经节细胞的无血清培养[目的]用无血清培养的方法体外培养螺旋神经节细胞,为下一步实验奠定实验基础[方法]采用3d内的SD大鼠取螺旋神经节组织,观察在无血清培养基(高糖DMEM+B27)+阿糖胞苷(cytosine arabinoside,Ara-C)中螺旋神经节细胞的生长情况,免疫组化鉴定培养的螺旋神经节细胞。[结果]使用高糖DMEM培养基及B27添加剂,联合5μM Ara-C作用48小时,能有效抑制非神经细胞增值,得到比较纯的SGCs。得到的细胞经免疫组化抗神经丝蛋白抗体证实为SGCs。[结论]通过无血清培养的方法,获得的SGCs纯度较高,细胞活性保持良好,可为体外研究螺旋神经节细胞的功能状态提供细胞模型。第二部分谷氨酸对体外培养的螺旋神经节细胞损伤作用[目的]探讨谷氨酸对体外原代培养的大鼠耳蜗螺旋神经节细胞兴奋性毒性作用。[方法] SGC在体外培养4天,加入1mmol/L谷氨酸,继续培养24后,用荧光显微镜观察Hoechest33258和PI双标的细胞形态改变和用激光共聚焦方法来观察细胞内游离钙离子浓度变化。[结果]体外培养4天的螺旋神经节细胞,用1mmol/L谷氨酸处理24h后,与对照组相比,出现大量的细胞受损,表现为死亡或凋亡,两组相比差异有统计学意义(P <0.05);用Fluo-3染色,激光共聚焦显微镜观察,发现加入谷氨酸后,80%的SGC胞内钙离子迅速增加,180s达到高峰。[结论]谷氨酸诱导的螺旋神经节细胞受损与钙离子内流有明显的关系。第三部分镁离子对谷氨酸诱发的螺旋神经节细胞损伤的保护作用[目的]探讨镁离子对谷氨酸所致的体外培养的大鼠耳蜗螺旋神经节细胞兴奋性毒性的保护作用。[方法] SGC在体外培养4天,加入1mmol/L谷氨酸和/或1mmol/L氯化镁后,继续培养24后,用激光共聚焦方法来观察Annexin-V-FITC和PI双标的细胞形态改变和细胞内游离钙离子浓度变化。[结果]体外培养4天的螺旋神经节细胞,用1mmol/L谷氨酸处理24后,出现大量的细胞受损,表现为死亡或凋亡,预先用1mmol/L的MgCl2可明显提高细胞的存活率(P<0.05);用Fluo-3染色,激光共聚焦显微镜观察,加入谷氨酸后,80%的SGC胞内钙离子迅速增加,180s达到高峰;预先加入MgCl2则可抑制谷氨酸介导的钙离子反应,在整个观察时段细胞内钙离子浓度无明显波动。[结论]镁离子可能通过抑制钙离子内流,来降低谷氨酸对体外培养的螺旋神经节细胞的细胞毒性。第四部分膳食镁含量的变化对SD大鼠的噪声性聋的影响[目的]研究饲料中不同镁水平对大鼠在声损伤中影响,评价镁在声损伤中的作用[方法] SD大鼠24只,随机分为2组,饲以人工合成饲料。组1大鼠给予低镁饲料(镁100mg/kg),组2饲料含适量镁(镁507 mg/kg),组3为高镁饲料(镁1000 mg/kg)。20天人工饲料饲养后,开始声损伤实验,暴露于倍频程噪声(4kHz中心频率)105 dB SPL 3h,测试暴露前后听性脑干反应(ABR)的阈值; DPOAE的幅值;血清和外淋巴液中镁离子浓度和血清总抗氧化能力。[结果]噪声暴露后,在ABR阈移上升幅度,DPOAE幅值增加幅度,血清和外淋巴液中镁离子浓度和血清总抗氧化能力等方面,高镁组与低镁组、适量镁组比较,差异均有显著性。[结论]膳食中镁含量的不同可以造成大鼠对噪声的敏感性不同,低镁可以引起大鼠对噪声的敏感性增加。