单核苷酸变异（single nucleotide variatioN,SNV）因其与疾病易感性、药物反应差异性、人类进化及种群多样性等相关而广受关注，虽然传统的检测方法能够实现单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）和点突变位点的准确分型，但是这些方法也都各自存在一些不足之处，而理想的检测方法应该具有高准确度、操作简单、高通量和低成本的特点，因此探索和建立高效且检测成本低的SNV的检测方法仍然十分必要。　　 三维聚丙烯酰胺凝胶DNA芯片因具有DNA高固定容量、高检测灵敏度、高杂交效率以及均一类液相反应微体系等特点，被越来越多的应用于各种生命科学研究领域，如甲基化检测、SNP研究、DNA序列测定、DNA克隆和抗体检测等。本课题以具有自主知识产权的三维聚丙烯酰胺凝胶DNA芯片为平台，开展新型SNV的检测方法的探索实践，提出了基于通用探针连接的两种新型检测方法。试验结果表明，这两种方法都能给出准确的分型结果，在保持DNA芯片高通量分析优势的同时，将这种优势大大向小样本数目的分析推进，能更灵活的用于探索性研究，同时也为临床样本的检测奠定了基础。　　 本论文的主要内容如下：　　 (1)通用探针连接与反向通用探针连接检测方法对DNA合成模板的模拟SNV分型　　 之前，我们实验室采用双色荧光杂交结合三维聚丙烯酰胺凝胶DNA芯片的方法检测SNV，该方法准确性高且操作简便，但不足的是每检测一个位点就需要一对荧光标记的探针，当分析的样本数目不是很大时（如数百个），探针费用平摊到每个样本的成本就会大大高于其他分析方法，且位点越多分型费用就越高，因此很不经济。为了保持三维聚丙烯酰胺凝胶DNA芯片的高通量分析的优势，并同时降低样本数目不多时的检测成本，我们提出了将三维DNA芯片与通用探针的连接反应相结合的SNV检测方法。初期大量的条件探索实验表明，采用通用探针连接检测和反向通用探针连接检测方法均能成功实现DNA合成模板中的SNV模拟分型，从而验证了这两种方法的可行性，为后续实际样本的SNV分型奠定了良好的基础。　　 (2)通用探针连接方法检测实际DNA样本中的SNV　　 通用探针连按检测方法的原理如下：首先，三维聚丙烯酰胺凝胶固定的PCR产物分析模板与测序引物完成杂交，然后，在T4 DNA连接酶的介导下，5’端磷酸化的测序引物与荧光标记的通用探针发生特异性连接反应，识别变异碱基。采用该方法，本研究工作成功检测了基因组DNA的聚合酶链式反应(polymerase chain reactioN,PCR)产物中的SNV，其中包括33个样本的SNP位点rs1800497C/T，83个样本的线粒体点突变位点：C3206T和A5301G。由于通用探针的特殊设计，该方法使用四条通用探针就能够实现所有SNV位点的分型，是一种准确、快速、高通量且低成本的新型检测技术。　　 (3)反向通用探针连接检测实际DNA样本中的SNV　　 尽管通用探针连接方法已较大的降低了SNV的检测成本，但是其不足之处是必须针对每个位点设计一条5’端磷酸化的测序引物。为了进一步节约成本，本课题提出了反向通用探针连接方法。在通用探针的3’端标记荧光基团，5’端修饰磷酸根，识别碱基位于5’端的第一个碱基，这种方法只需针对每个位点设计一条普通的测序引物，在DNA连接酶的作用下，由探针的5’端识别碱基信息，进行特异性连接，从而检测出SNV。采用反向通用探针连接技术，准确检测了多个DNA样本的SNV，包括一个SNP位点rs13317C/T，两个线粒体点突变位点：C3206T和A5301G。该方法在保持三维DNA芯片的高通量优势的同时，进一步降低了小样本数目的分型费用，大大拓展了三维DNA芯片的使用范围。