研究背景:前列腺癌在美国是最常见的实体恶性肿瘤。2005年约有23.2万前列腺癌新病例并有近3万前列腺癌病人死亡。通常在亚洲尤其在中国的前列腺癌发病率最低,但近年发病率呈明显上升趋势。局限性或转移性的前列腺癌标准的初始治疗是雄激素去势治疗(Androgen Deprivation Therapy,ADT),可采用双侧睾丸切除或促黄体生成素释放激素(Luteinizing Hormone-Releasing Hormone,LHRH)治疗。转移性前列腺癌患者对于雄激素依赖(Androgen Dependence)通常约14-30个月,然后进展为对雄激素非依赖性状态(Androgen-IndependenceProstate Cancer,AIPC)。在此期间,尽管雄激素维持在去势水平,但对ADH治疗无效。部分病人对二次激素治疗仍有反应,随后即失去对激素的反应性,进入激素难治性(Hormone Refractory Prostate Cancer,HRPC)状态。处于AIPC和HRPC状态的患者可以有各种不同的表现,如前列腺特异性抗原(Prostatic SpecificAntigen,PSA)升高,伴随或者不伴随转移,影像学改变,包括骨扫描或软组织浸润以及加重的临床症状,如疼痛加剧,排尿梗阻加重。从组织学检查看,AIPC和HRPC于高度抵抗状态,化疗反应差,仅可延长12月。前列腺癌激素转化的分子生物学机制尚不完全明了。前列腺癌激素非依赖性表型的获得是前列腺癌治疗的最严重的问题。尽管已有数个实验模型可用来进行激素依赖性研究,但其在激素非依赖性研究中的应用受限。LNCaP是一个人前列腺癌细胞系,常常被用来进行各种体外实验。该细胞系是自前列腺癌转移的锁骨上淋巴结分离而来,表达雄激素受体(Androgen Receptor,AR),呈现对雄激素敏感的生长状态。尽管在培养液中雄激素的活性水平与生理状态相当,但随着的LNCaP传代,它的生长将逐渐失去对雄激素的依赖性,很好地模拟前列腺癌临床进展过程,是一个非常理想的前列腺癌实验模型。近年来发现,生长抑素(Somatostatin,sms)以及其类似物能够通过数种调节机制来抑制前列腺癌的生长,通过抑制生长激素、胰岛素等分泌,通过与生长抑素受体1-5(somatostatin receptor,sstr)的结合,抑制细胞的有丝分裂,从而抑制细胞的生长。激素非依赖性前列腺癌表达sstr受体。sms类似物,如奥曲肽(Octreotide)目前仅有少量临床实验,且仅表现出有限的作用。HRPC主要表达sstr1受体,而奥曲肽仅作用于sstr2和sstr5,这也是为什么奥曲肽在前列腺癌的治疗中受限的可能原因。生长抑素类似物与sstr1的高度亲和性成为治疗HRPC的一个有效的选择。最近我们报道了一种新的奥曲肽类似物(smsdx),具有和sstr1-5受体广泛的亲和性,这种新药物是基于天然生长抑素(sms14)而开发的。体外实验和动物实验显示生长抑素类似物能够抑制前列腺癌细胞的生长。应用前列腺癌细胞系LNCaP的实验也提示生长抑素对LNCaP的细胞增殖和蛋白分泌有抑制作用,该作用是通过激活蛋白酶phosphotyrosyl protein phosphatases实现的。在后基因组时代,生物学的中心任务是认识基因组的功能。由于基因功能主要是通过其表达蛋白质来实现的,要了解基因的全部信息,必须深入研究不同基因编码的蛋白质,因此蛋白质组学在生命科学研究中已具有重要的地位。肿瘤蛋白组学(Oncoproteomics)是应用蛋白组学技术研究肿瘤细胞中的蛋白以及其相互关系到学科。肿瘤细胞或组织蛋白质样本通常经过双向电泳等技术可以按不同大小分子量、等电点或类型得以分离(Profiling),然后通过质谱技术和蛋白质数据库比较,进一步将特殊的感兴趣的蛋白质鉴定出来。肿瘤蛋白质组学是整个蛋白质组学研究中的一项重要内容,通过蛋白质组分析技术将能够从细胞整体水平上认识在肿瘤的发生、发展过程中蛋白表达谱的变化,为寻找特异的肿瘤标志物这一研究领域带来了新的希望。肿瘤蛋白组学有可能为临床实践带来根本性的改革,包括肿瘤诊断、基于蛋白组学平台的作为组织病理学补充的肿瘤筛选、个性化治疗方案组合的选择、肿瘤特异性蛋白靶目标的确定、实时评估治疗效果和药物毒性、依据与肿瘤预后及耐药相关的肿瘤蛋白调节网络合理地调节治疗方案。另外,肿瘤蛋白组学也可用来发现新药和确定药物效果。研究目的:在建立研究前列腺癌蛋白组学技术的基础上,确定生长抑素及其类似物对前列腺癌细胞系LNCaP在蛋白水平的量化影响。通过蛋白的质谱分析,来确定被生长抑素及其类似物影响到蛋白质,并且通过资料分析,寻找可能的肿瘤标记物。通过蛋白组学技术,研究前列腺癌激素依赖性转化的相关调节蛋白。材料和方法:为了了解和阐明sms以及smsdx的分子水平作用机制,我们采用蛋白组学分析方法进行研究。首先用sms以及smsdx处理LNCaP细胞,1nM3天。然后按照标准的双相凝胶(2-Dimansional Electrophoresis,2-DE)电泳方法进行蛋白的提取,浓度测定,蛋白裂解。固定胶条(Immobilized pH Gradients,IPG)的使用,不仅提高了胞内蛋白的分离效率,而且增加了双相电泳的可重复性。本实验采用11cm的IPG strip(pH3-10)进行一相蛋白分离,应用12.5%的Tris-HCI成品胶根据蛋白质的分子量进行双相蛋白的分离,采用敏感的银染方法(SilverStaining)进行染色,扫描图像,用PDQuest软件系统进行定量分析,采用T-studentTest和Mann-Whitney进行统计学分析,找出差异表达的蛋白,以sms处理组作为阳性对照,未用药物处理组作为阴性对照,来确定sms和smsdx对前列腺癌细胞蛋白表达的差异性和共同性。然后采用基质激光辅助的解吸附/电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MassSpectrometry,MALDI-TOF-MS)分析方法,对受影响的蛋白质进行定性分析,通过与资料库的对照研究,确定相关蛋白,从而来确定前列腺癌激素依赖性转化的调节蛋白以及可能的调节途径。筛选可能的生物标记物以及可能的药物靶蛋白。结果:1.在用1nM sms和smsdx处理前列腺癌细胞系LNCaP 3天以后,扫描获取银染的凝胶图像,应用PDQuest软件系统进行分析。首先检测3组胶以及每组胶成员之间的相关系数(correlation coefficient)位于0.85-0.92之间,显示出高度的可重复性。3个样本组(阴性对照组,sms阳性对照组以及smsdx处理组)显示出对蛋白影响的共同性和差异性。在smsdx处理组中,与阳性对照组(sms处理组)比较,我们发现有63个蛋白点上调表达(高于2倍)(P值小于0.05)。在smsdx处理组中,与阴性对照组比较,我们发现有489个蛋白点下调表达(高于2倍)。在sms处理组中,44个蛋白点上调表达(高于2倍)(P值小于0,05),有386个蛋白点下调表达(高于2倍)。在上调表达的63个蛋白点中,有24个蛋白点受sms和smsdx共同上调表达(高于2倍),约占33,33%。受sms和smsdx影响,有295个蛋白点共同下调表达(高于2倍)。2.本实验有三个组,阴性对照组,阳性对照组(sms组),smsdx处理组。通过PDQuest软件系统进行分析,应用Mann-Whitney方法检测,采用MALDI-TOF-MS/MS方法有172个蛋白点(protein spot)得到分析,共鉴定出140种蛋白质。这是由于蛋白质的同构异功体的存在所致。参照蛋白基因信息资料库Swiss-Prot,Genome Brower以及National Center for Biotechnology Information(NCBI)等进行生物信息分析,按照这些蛋白已知的生化功能,如代谢、信号传导、细胞结构的维护、细胞间反应、运输、转录调节以及细胞周期调节等对鉴定出的蛋白质进行分类。研究发现,线粒体及线粒体相关蛋白明显受sms和smsdx的影响,大部分出现上调表达(高于2倍)。与细胞凋亡有关的蛋白则出现上调表达(如VDAC1,VDAC2),有出现下调表达(如PRDX2,TCTP)。PRDX2蛋白的表达变化高于2倍,而其他蛋白则低于2倍。sms和smsdx引发的线粒体蛋白的上调似乎也影响到细胞凋亡相关蛋白的表达。3.在前列腺癌种蛋白在前列腺癌激素依赖性细胞系LNCaP的培养过程中,对细胞系行逐渐的去激素化培养,我们最终建立了对激素非依赖性细胞系LNCaP-s。基于我们建立的列腺癌激素依赖性细胞系LNCaP蛋白资料库,共鉴定出22种线粒体蛋白和22种肿瘤相关蛋白。通过文献检索和查寻蛋白信息库,发现16种蛋白可作为与肿瘤相关的候选标记物。其中11种蛋白在前列腺癌激素依赖性细胞系LNCaP中与激素非依赖性细胞系中有明显的差异性表达。通过对照研究,发现在这2种细胞系中,有150种蛋白差异性表达(高于2倍),呈现出上调和下调表达。与LNCaP蛋白资料库对照,鉴定出57种蛋白。仅有7种LNCaP-s蛋白出现上调表达,其余均为下调表达。通过定量分析,有6种蛋白仅出现在LNCaP细胞系中。这些蛋白参与各种细胞功能活动中,如信号传导以及细胞凋亡等。结论:1.生长抑素类似物(smsdx)在对蛋白表达水平的影响上具有与生长抑素类似的作用。该研究结果显示出生长抑素类似物的效果和细胞在分子水平的反应。蛋白组学技术是一种可靠的能够鉴定出各种多肽的先进手段,为临床上肿瘤标记物的鉴定提供了可靠的保证。2.生长抑素以及生长抑素类似物(smsdx),能够共同调节前列腺癌细胞系LNCaP中的重要蛋白,表现出相似的作用机制和影响程度。鉴定出的线粒体及线粒体相关蛋白,在细胞凋亡过程中起着非常重要的作用。出现差异表达的相关肿瘤蛋白的鉴定,为筛选可靠的肿瘤标记物以及治疗靶蛋白提供了有效的信息。3.本课题组通过去激素化培养前列腺癌激素依赖性细胞系LNCaP,得到的对激素非依赖性细胞系LNCaP-s,为我们进一步认识和了解临床前列腺癌激素依赖性转化的机制提供了一个模型。鉴定出的蛋白质,如Stathmin,hnRNP和TCTP等有可能成为治疗前列腺癌的靶目标和早期诊断前列腺癌的标记物。意义:肿瘤蛋白组学技术在前列腺癌的治疗和诊断中具有重要的应用价值,通过对本研究在前列腺癌细胞系中蛋白表达的定性和定量分析,为明确生长抑素以及生长抑素类似物在难治性前列腺癌的治疗中的作用机制打下了可信的基础,提供了有益的信息。