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Ⅰ.随着空气污染加剧促使环境的不断恶化,以及饮食、压力等多方面对机体的威胁,现在,癌症已经成为人类的头号杀手,是威胁人类健康的最主要疾病。由于治疗癌症的传统疗法受到多种原因限制,治疗效果并不理想并且毒副作用明显。随着医学科技的发展,治疗癌症的手段不断探索与更新,肿瘤的生物学疗法给患者带来了曙光。结合基因治疗和病毒治疗两种癌症疗法的优势而提出的“癌症的靶向基因-病毒治疗”策略对选择病毒载体和治疗基因的活性提出了新的靶标。基于此策略,我们利用安全性高、复制快和包装容量大等特点的痘苗病毒携带ING4和GM-CSF构建了一种新的癌症靶向基因-病毒。已知,ING4基因广泛参与肿瘤的发生发展过程,其抑癌功能包括抑制HIF-1的活性、增强P53基因的活性,从而促进肿瘤细胞死亡;GM-CSF是一种粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子,能够激活机体的免疫系统来增强抗肿瘤效果。本研究以痘苗病毒为载体,使其携带ING4或GM-CSF两个治疗基因,从而包装出安全性高且杀伤效果显著的单基因溶瘤痘苗病毒OncoPox-ING4和Onco PoxGMCSF。重组痘苗病毒的构建将ING4和GMCSF两个基因插入到痘苗病毒pCB质粒载体的TK区,随后病毒和质粒在细胞内发生同源重组,目的基因将会插入到野生型痘苗病毒基因组,从而获得携带有双基因的OncoPox-ING4和OncoPoxGMCSF溶瘤痘苗病毒。构建的重组痘苗病毒OncoPox-ING4和OncoPox-GMCSF经大量扩增、纯化和滴度测定后感染细胞,经Western blot检测出有目的基因的蛋白表达。接着用重组痘苗病毒来杀伤肺癌、乳腺癌、肝癌、结肠癌、胰腺癌和脑胶质瘤等细胞,通过观察细胞的形态学变化、结晶紫染色分析病理学效应、Hoechst检测凋亡诱导作用、MTT试验检测细胞的存活率以及Western Blot检测相关蛋白的表达,结果表明溶瘤痘病毒OncoPox-ING4对几种癌细胞的诱导凋亡效果最显著,同时也验证了其可能是通过抑制NF-kB信号通路中的某一个环节来抑制肿瘤生长。因此,痘病毒OncoPox-ING4对杀伤癌细胞具有广谱性且抗癌作用显著,验证了“靶向基因病毒治疗策略”的合理性,为治疗癌症提供了新的方法。Ⅱ.目前,溶瘤腺病毒用于治疗癌症是一个热点。本课题研究目的是检测溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL-IETD-Smac联合SNS-032治疗胰腺癌的协同作用。体外试验表明了SNS-032能够增强ZD55-TRAIL-IETD-Smac对胰腺癌的杀伤,诱导胰腺癌细胞的凋亡。Western blot试验表明SNS-032通过影响抗凋亡蛋白如CDK-2、CDK-9、Mcl-1、XIAP和Bcl-2等增强溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL-IETD-Smac对胰腺癌细胞凋亡作用。体内试验也证明了SNS-032能够促进ZD55-TRAIL-IETD-Smac对胰腺癌的杀伤。本研究分别通过体内和体外试验证明,SNS-032能够加强溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL-IETD-Smac对胰腺癌的杀伤,使其凋亡。试验数据表明,联合SNS-032和ZD55-TRAIL-IETD-Smac对于胰腺癌是个合理的治疗方法。