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背景急性肝功能衰竭(acute liver failure,ALF)是一种严重的危重急症,由大面积的肝细胞坏死引起,以迅速进展的肝性脑病及严重的肝功能损坏为特点,病死率极高。目前,原位肝移植是最有效的治疗手段,但供肝短缺、免疫排斥和高额费用限制了其应用。于是,生物人工肝(bioartificial liver,BAL)开始作为肝移植的辅助或替代疗法,促进终末期肝病的恢复。但是,生物人工肝技术只能代替肝脏的部分解毒功能,疗效并不令人满意。因此,迫切需要探索新的治疗方法以挽救肝衰竭患者的生命。间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)目前已成为干细胞研究的热点。MSCs是一类多能干细胞,具有多向分化的潜能,大量的研究报道MSCs有益组织修复与重建。MSCs可向损伤组织趋化及植入,通过下调炎症细胞因子和上调抗炎症因子来调节炎症反应,并且MSCs是一种低免疫原性且具有免疫抑制作用的细胞,可抑制T细胞,NK细胞,调节树突状细胞的活动。MSCs可来源于不同的组织,如骨髓、脂肪、脐带、胎盘、羊膜等；其中脂肪来源的间充质干细胞与骨髓间充质干细胞有着相似的生物学特性,而且来源丰富、取材方便,免疫原性低,不受伦理、道德及法律方面的争论与限制,因此具有广阔的基础研究及临床应用前景。研究表明,脂肪间充质干细胞(adipose derived mesenchymal stem cells, ADMSCs)可以分泌多种细胞因子,通过自分泌或旁分泌的形式作用于周围细胞,发挥重要的生物学作用。除此之外,还广泛参与免疫调节,及细胞增殖、凋亡、血管再生等病理生理作用。目的1、从增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)转基因小鼠中分离、培养脂肪间充质干细胞,并进行鉴定。2、观察移植脂肪间充质干细胞对四氯化碳(carbon tetrachloride, CCl4)诱导的小鼠急性肝衰竭的治疗作用。方法：一、EGFP-ADMSCs的分离、培养及鉴定1、取出增强型绿色荧光蛋白转基因小鼠的脂肪垫,剪碎后胶原酶消化,含10%优等胎牛血清的a-MEM培养液培养,获得ADMSCS,进行体外培养、扩增；2、流式细胞仪技术检测第3代EGFP-ADMSCs细胞表面标志物CD105,CD44, CD45, CD34的表达情况；3、并且进行成骨、成脂诱导分化,分别采用茜素红钙盐染色和油红O染色进行鉴定。二、细胞移植后对急性肝衰竭的治疗作用1、给予剂量为2.8ml/kg CCl4,与橄榄油混合后腹腔注射构建小鼠急性肝衰竭模型,实验分组：尾静脉注射EGFP-ADMSCs实验组及PBS对照组、脾脏注射EGFP-ADMSCs实验组及PBS对照组；2、分别于细胞移植后7天、14天、28天取肝组织进行冰冻切片,荧光显微镜下观察移植细胞的趋化、定植情况；3、细胞移植前及移植后7天、14天后检测外周血中ALT、AST的含量；4、四组急性肝衰竭小鼠治疗7天后进行生存分析；5、分别于细胞移植后7天、14天、28天进行HE染色观察肝脏组织的病理改变；6、免疫荧光染色检测细胞移植28天后ALB、CK-18的表达情况。结果一、EGFP-ADMSCs的分离、培养及鉴定1、成功获得了稳定表达EGFP的ADMSCs,显微镜下可见脂肪间充质干细胞大小均一,呈长梭形、纺锤形,并呈现炫目的绿色荧光,传代15次后荧光无减弱。2、经流式细胞仪检测P3代细胞的表面标记物的表达情况,结果显示其表面表达粘附分子CD105、CD44的阳性率在95%以上,而造血干细胞的表面标志CD34,CD45几乎不表达。3、EGFP-ADMSCs经成骨诱导21d后茜素红染色可见橘红色钙盐沉积,经成脂诱导14d后油红O染色阳性,并且分化后细胞的EGFP表达不受影响。二、细胞移植后对急性肝衰竭的治疗作用1、EGFP-ADMSCs分别经尾静脉、脾脏移植后荧光显微镜下观察小鼠的肝脏冰冻切片,肝小叶内、中央静脉周围可见绿色荧光细胞,细胞大小为正常肝细胞的1/3-1/2,与周围细胞相比,呈现高亮度的绿色荧光；而对照组小鼠肝内未见绿色荧光细胞。细胞移植28天后,肝脏内仍可见绿色荧光细胞,荧光细胞成团聚集、局灶状,细胞形态与肝细胞相似。2、实验前,2.8ml/kg CC14剂量成功构建急性肝衰竭的小鼠模型,肝脏内可见肝细胞大片坏死,5天内死亡率达85%；细胞移植后,肝脏切片HE染色可见7天后肝细胞明显再生,肝小叶重建,28天后基本恢复正常结构。3、细胞移植7天后实验组小鼠ALTAST明显降低,14天后恢复到正常水平；尾静脉实验组生存率达80%,脾脏移植实验组生存率为50%,而对照组死亡率为85%。4、细胞移植28天后,肝脏冰冻切片进行免疫荧光染色,可见绿色荧光细胞表达ALB、CK-18。结论1、从EGFP转基因小鼠脂肪中成功分离出ADMSCs,分离的细胞具有自我更新增殖和多向分化的干细胞特性,传代15次后均可以稳定表达绿色荧光,为进一步研究提供了良好的示踪工具。2、成功建立CCl4诱导的C57BL/6背景小鼠的急性肝衰竭模型。3、ADMSCs经尾静脉移植可提高急性肝衰竭小鼠生存率,改善小鼠的肝功能；植入的细胞能够在受体小鼠肝脏中存活、增殖,并分化为肝样细胞。这为暴发性肝衰竭的治疗提供了一种新途径。