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妊娠是一个复杂的生理过程。从免疫学角度来看,生理妊娠类似于同种移植,作为同种移植物的胚胎在母体内存活直至分娩,实际上反映母体对胚胎的免疫耐受；在正常妊娠过程中,母体对携带父系抗原的胚胎不仅不排斥,而且通过精细的母-胎对话建立独特的母-胎界面免疫耐受微环境,允许胎儿在母体子宫内生长直到分娩；母体对胚胎的免疫排斥将导致妊娠失败。因此对于母-胎界面免疫耐受的研究对于人类自然流产等妊娠疾患的防治具有重要意义。由于母-胎免疫耐受是自然界免疫逃逸良好的生理性模型,对移植免疫学和肿瘤免疫学研究将产生积极推动作用。母-胎界面主要包括滋养细胞、蜕膜基质细胞、蜕膜腺上皮细胞以及免疫细胞。其中50-70%的蜕膜免疫细胞为蜕膜NK细胞。多年来人们从不同的角度研究母-胎界面发生的生物学事件,阐述母-胎免疫调节的机制,其中包括母-胎界面Th2型免疫优势的形成,及调节性T细胞(Treg)数量与功能的变化。近年来占据母-胎界面免疫细胞绝大多数的NK细胞越来越引起人们关注。趋化因子是一类由67-127个氨基酸组成的细胞因子,通过与受体结合发挥多种生物学作用。一种趋化因子可以和一个或多个受体结合,一种趋化因子受体也可有多个趋化因子作为配体。通过配受体相互作用,构成了人体内复杂的趋化因子网络,共同执行着复杂的生物学功能。对趋化因子的功能的研究最初开始于炎症；随研究深入,人们发现趋化因子不仅具有趋化白细胞向炎症局部游走的作用,还参与机体发育,肿瘤发生及进展等过程。我们课题组前期已经研究了CXCL12/CXCR4在母-胎界面的生物学功能,及参与母-胎免疫调节的机制。因此,本研究选择了趋化因子受体CXCR4,研究其在母-胎界面免疫细胞,特别是蜕膜NK细胞的分布,以揭示基于CXCR4的蜕膜NK细胞的独特分群以及CXCR4+蜕膜NK细胞在母-胎免疫调节中的作用。第一部分基于CXCR4表达的蜕膜NK细胞的独特分群目的评价基于表达CXCR4的蜕膜NK细胞的表型及功能差异方法收集正常早孕期妇女外周血,正常非孕育龄期妇女子宫内膜组织,正常早孕期妇女蜕膜组织,早孕期无明确原因而自然流产患者蜕膜组织,采用流式细胞术分析外周及蜕膜免疫细胞中基于CXCR4表达的NK细胞的表型、细胞因子的表达以及细胞毒活性。结果 相对于蜕膜CXCR4- NK细胞,蜕膜CXCR4+NK细胞低表达激活性受体NKp30, NKp44, NKp46;低表达抑制性受体KIR2DL1, KIR3DL1, CD94;低表达Thl型细胞因子IFN-y, TNF-α;高表达Th2型细胞因子IL-4,IL-10；高表达IL-8, TGF-β;低表达穿孔素和颗粒酶。与正常非孕育龄期妇女子宫内膜和早孕期无明确原因而自然流产患者蜕膜比较,蜕膜CXCR4+NK细胞在正常早孕期妇女蜕膜局部显著富集。结论 蜕膜CXCR4+NK细胞的表型及功能独特,在正常早孕期妇女蜕膜局部显著富集。第二部分入早孕滋养细胞调控外周CXCRM+及CXCR4-NK细胞表型及功能目的 解析人早孕滋养细胞对外周CXCR4+及CXCR4-NK细胞表型及功能的调节作用方法 分离纯化人早孕外周NK细胞,外周CXCR4+及CXCR4" NK细胞,建立人早孕滋养细胞与外周NK细胞或外周CXCR4+及CXCR4- NK细胞共培养体系,流式细胞术分析外周CXCR4+及CXCR4-NK细胞表型及细胞因子表达,及细胞毒性变化。趋化实验分析滋养细胞对于外周NK细胞的趋化作用。结果早孕滋养细胞上调外周CXCR4-NK细胞NKp30, NKp44, NKp46, KIR2DL1, KIR3DL1的表达；上调外周CXCR4- NK细胞IFN-y的表达；上调外周CXCR4-NK细胞Perforin和GraB的表达；早孕滋养细胞下调外周CXCR4+NK细胞NKp30, KIR2DL1, KIR3DL1的表达；下调外周CXCR4+NK细胞IFN-γ,TNF-a的表达；上调外周CXCR4+NK细胞IL-4, IL-10, TGF-p, IL-8的表达；下调外周CXCR4+NK细胞Perforin和GraB的表达。滋养细胞可上调外周NK细胞CD56的表达,降低外周NK细胞CXCR4的表达,使外周NK细胞的表型向蜕膜NK细胞发生偏移。滋养细胞可使外周CXCR4+NK细胞朝向蜕膜CXCR4+及CXCR4-NK细胞分化。早孕滋养细胞通过分泌CXCL12对外周NK细胞产生趋化作用。结论 母-胎界面滋养细胞能够诱导外周NK细胞的表型和功能向蜕膜NK细胞发生偏移,滋养细胞可使外周CXCR4+NK细胞朝向蜕膜CXCR4+及CXCR4- NK细胞分化。滋养细胞通过分泌CXCL12对外周NK细胞产生趋化作用,有利于NK细胞在母-胎界面富集及发挥作用。第三部分蜕膜CXCR4+ NK诱导母-胎界面Th2型免疫优势和母-胎耐受目的 解析蜕膜CXCR4+ NK细胞在母-胎界面Th2型免疫优势和母-胎耐受建立过程中的作用方法流式细胞术分析蜕膜CXCR4+ NK细胞,蜕膜CXCR4-NK细胞,外周NK细胞分别与naive CD4+T细胞共培养5天后的naive CD4+T细胞膜表面分子、胞内细胞因子和核转录因子的表达水平；以及蜕膜CXCR4+NK细胞,蜕膜CXCR4-NK细胞,外周NK细胞分别与CD4+CD25" T细胞共培养5天后的CD4+CD25-T细胞膜表面分子及核转录因子的表达水平。结果蜕膜CXCR4+NK细胞诱导naive CD4+T细胞上调Th2型细胞因子IL-4,核转录因子GATA-3的表达；下调Thl型细胞因子IFN-y,核转录因子T-bet的表达,呈Th2型免疫偏移；但对naive CD4+T细胞Foxp3的表达无显著影响；蜕膜CXCR4+NK细胞上调CD4+CD25-T细胞PD-1的表达,诱导CD4+CD25-T细胞转化为CD4+Foxp3+Treg细胞,有利于Treg细胞扩增和功能增强。结论蜕膜CXCR4+NK细胞诱导naive CD4+T细胞向Th2型细胞分化,蜕膜CXCR4+NK细胞诱导CD4+CD25-T细胞转化为CD4+Foxp3+Treg细胞,促进母-胎界面Th2型免疫优势和免疫耐受。第四部分母-胎界面NK细胞异常导致Th1型偏移及自然流产目的 通过建立正常妊娠,自然流产及NK细胞删除孕鼠模型,解析母-胎界面NK细胞对母-胎界面免疫微环境及妊娠结局的作用。方法 建立正常妊娠小鼠模型及自然流产小鼠模型,在小鼠孕10.5天原代分离得到小鼠蜕膜免疫活性细胞,利用流式细胞术分别分析孕10.5天小鼠蜕膜Th1/2型免疫偏移,并观察小鼠胚胎吸收率；建立NK细胞删除孕鼠模型和正常妊娠小鼠模型,在小鼠孕10.5天原代分离得到小鼠蜕膜免疫活性细胞,利用流式细胞术分别分析孕10.5天小鼠蜕膜Th1/2型免疫偏移,并观察小鼠胚胎吸收率。结果 孕10.5天时,与正常妊娠小鼠相比,自然流产小鼠胚胎吸收率明显升高,蜕膜CXCR4+NK细胞表达下降,母-胎界面发生Thl型免疫偏移；孕10.5天时,与正常妊娠小鼠相比,NK细胞删除孕鼠胚胎吸收率明显升高,母-胎界面发生Thl型免疫偏移。结论早孕期自然流产时,蜕膜CXCR4+NK细胞显著下降；NK细胞删除可致母-胎界面Thl型免疫偏移,及自然流产的发生,提示蜕膜NK细胞在正常妊娠的建立和维持中发挥重要作用。小结基于CXCR4及CD56的表达区分人NK细胞,早孕期母-胎界面蜕膜CXCR4+NK细胞呈现耐受表型及Th2型优势,在正常早孕妇女蜕膜组织中显著富集。滋养细胞通过分泌CXCL12对外周NK细胞产生趋化作用,并能够诱导外周NK细胞的表型和功能向蜕膜NK细胞发生偏移,有利于NK细胞在母-胎界面富集以及发挥作用。蜕膜CXCR4+NK细胞能够诱导naive CD4+T细胞向Th2型细胞分化,诱导CD4+CD25- T细胞向CD4+Foxp3+Treg细胞转化,促进母-胎界面Th2型免疫优势和免疫耐受。NK细胞删除可致母-胎界面Thl型免疫偏移,及自然流产的发生。这些结果提示：NK细胞,特别是蜕膜CXCR44+NK细胞,在正常妊娠的建立和维持中发挥重要作用。