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海参为海洋无脊椎动物,隶属于棘皮动物门,海参纲。海参体壁含具有显著生物活性的酸性多糖,如岩藻糖化糖胺聚糖(fucosylated glycosaminoglycan,FG)和岩藻聚糖硫酸酯(fucan sulfate,FS),还含有中性葡聚糖(neutral glycan,NG),其中,天然FG具有广泛的药理活性,包括抑制内源性因子X酶(Xase,FVIIIa-FIXa-PL-Ca2+酶复合物,FXase)的强效抗凝活性,表面激活和血小板激活活性等,而其一定分子量范围的解聚产物(depolymerized FG,dFG)可在保持选择性FXase抑制活性的同时,降低或消除对因子Ⅻ和血小板的影响。海参来源的FS 一般由相对规则的结构单元组成,也具有一定的抗凝活性,其药理学机制比较复杂。天然FG、FS既存在共性结构特征,又可见丰富的结构多样性特征,主要表现在不同物种来源的FG和/或FS的组成单糖的糖苷键连接方式和硫酸酯化形式存在丰富的变化。为进一步认识天然海参体壁多糖的结构多样性,本文研究秘鲁乌参(P.mollis)体壁所含多糖的类型、理化性质、结构特征,并且分析其体壁多糖PmFG和PmFS的抗凝活性及构效关系,为研究和发现新型抗凝抗血栓药物做出积极的探索。本课题主要的研究方法及结果如下:(1)P.mollis多糖的提取、分离及理化性质分析:通过酶解-碱解法提取,提取物醇沉分级和强阴离子交换柱层析等方法从P.mollis体壁提取分离得到四个多糖组分:PmFG、PmFS、PmNG-1 和 PmNG-2。高效凝胶渗透色谱(High performance gel permeation chromatography,HPGPC)分析显示,所得多糖组分均具有良好的均一性。所得多糖的基本理化性质通过分子量、单糖组成、硫酸酯基含量、旋光度、红外光谱(IR)、质谱(MS)、核磁(NMR)等方法分析。(2)PmFG、PmFS和PmNG的基本化学结构解析:高分子量的PmFG和PmNG-1分别以过氧化氢和三氟乙酸处理得到解聚产物dPmFG和dPmNG。dPmFG经凝胶层析分级得到dPmFG-I-dPmFG-III。PmFS通过凝胶层析分级得到PmFS-I-PmFS-III。根据PmFG及其解聚产物(dPmFG-II)的1D和2D NMR的波谱解析判断,PmFG的主链结构由D-葡萄糖醛酸(GlcA)和4,6-二硫酸化-D-乙酰氨基半乳糖(GalNAc4S6S)以β1,3、β1,4糖苷键交替连接形成,L-Fuc单糖以侧链的形式连接于GlcA的C-3位。即结构为{-4-[L-FucR-α1,3]-D-GlcA-β1,3-D-GalNAc4S6s-β1-}n,式中,FucR为Fuc3S4S、Fuc2S4S或Fuc4S(摩尔比约为2.5:2:1)。根据PmFS的1D/2DNMR波谱解析判断,其化学结构为{-4-L-Fuc2S-α1,4-[L-FucR-α1,3]-L-Fuc2S-α1,4-L-Fuc2S-α1-}n,式中,FucR为FuC4S或Fuc3S(摩尔比约为4:1),即主链每三个重复结构单元含有约一个L-Fuc单糖侧链。PmFS 重均分子量(Weight-average molecular weight,Mw)约6.12 kDa,远低于目前见于报道的其它海参来源的FS。PmNG-1和PmNG-2均为具有类似糖原结构的葡聚糖,其所含Glc主要通过α1,4相互连接成糖链,并存在通过α1,6糖苷键连接的分支。(3)PmFG的系列寡糖的制备:采用具有糖苷键选择性的β-消除法解聚PmFG,该方法选择性断裂连接于D-GlcA的C-4位糖苷键,解聚产物(d’PmFG)的还原端为不饱和已糖醛酸(L-△4,5G1cA,AU),其具有λ232nm的最大紫外吸收。d’PmFG通过凝胶柱层析分离得到系列寡糖组分Ⅰ-Ⅳ,结合HPGPC及NMR解析其分别为三糖、五糖、八糖、十一糖。寡糖组分Ⅰ的结构为L-FucR-α1,3-L-△4,5GlcA-α1,3-D-GalNAc4S6S-ol;寡糖组分Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ具有L-FucR-α1,3-L-△4,5GlcA-α1,3-D-GalNAc4S6S-β1,4-{[L-FucR-α13-]-D-GlcA-β1,3-LD-GalNAc4S6s-β1,4-}n-[L-FucR-α1,3+D-GlcA-ol 的结构通式,式中n分别为0、1 和2,R为3S4S、2S4S或4S。(4)抗凝活性及构效关系:对人质控血浆活化部分凝血活酶时间(Activated partial thromboplastin time,APTT),凝血酶原时间(Prothrombin time,PT)及凝血酶时间(Thrombin time,TT)的影响试验结果显示,在试验浓度范围(3.5 μg/mL～24.3 μg/mL)内,PmFG与PmFS均可明显延长APTT,而对PT和TT无显著影响;PmNG-1和PmNG-2对APTT,PT及TT均无显著影响。体外凝血因子影响试验结果显示,PmFG及其解聚产物具有强效的内源性FXase抑制活性,且其活性随分子量降低而减弱;PmFS及其分级组分也具有显著的内源性FXase抑制活性,而分子量变化对活性的影响不大。对于β-消除解聚法所得FG寡糖而言,八糖是具有强效抑制内源性FXase活性的最小结构片段。