百日草花序点滴法及花粉管通道法转基因技术研究

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百日草(Zinnia elegans Jacq.)为菊科百日草属一年生草本花卉,花色变化丰富且鲜明艳丽,在园林绿化中应用广泛。百日草育种主要通过常规选育,育种周期长,存在远缘杂交不亲和的限制,建立有效的转化体系,对缩短育种年限,打破生殖隔离,创造新品种具有重要意义。由于百日草在茎段组织培养过程中,随着继代次数越多,越容易开花,目前尚未建立有效的再生体系。本论文在非组培转化方法中的花序点滴法及花粉管通道法相关技术研究的基础上,通过分析两种转化方法的主要影响因素,进行百日草转化技术研究适用性探索,期望建立适用于百日草的转化体系。主要结果如下:(1)百日草花序形态学及细胞学结构分析。以百日草自交系S5、J7N和雄性不育两用系Mah001AB为实验材料进行百日草花蕾横径大小变化及外部形态情况进行观察分析,并以S5蕾3时期的花序内不同轮次的小花为研究对象,观察测量其外部形态,并观察对应的子房心皮发育情况。结果表明:(1)百日草自现蕾到开花阶段,花蕾横径大小与时间之间存在高度线性关系,可根据花序外部形态特征推测其发育时期。(2)百日草S5花3时期的花序中,最外2轮是舌状花,第3~11轮为筒状花,相间两轮的小花的苞片形态(长度、宽度)、花瓣形态(颜色、长度)雄蕊形态(花丝长度、花药长度及颜色)、雌蕊形态(子房长度、子房宽度、子房厚度、花柱长度、柱头长度)呈现显著性差异,可根据小花外部形态特征推测其发育时期。(3)雄蕊发育早于雌蕊成熟,处于蕾7及以后发育时期的小花心皮处于开放状态。(2)农杆菌花结构中分布及数量统计分析。通过提取不同天数被点滴处理后的花序组织液,得出农杆菌在花器官中生长良好,在处理后的4~6天维持在10~5数量级水平,之后迅速减少,8天后仍有10~3数量级的菌落存在。利用点滴处理后的子房进行GUS组织染色,发现子房的全部或大部分被染色,胚珠部分均被染色,农杆菌能够有效进入花器内部。(3)卡那霉素选择压的确定。通过利用不同浓度的卡那霉素溶液催芽百日草种子、涂抹子叶片和子叶期涂抹顶芽的三种方式,结果表明:在百日草子叶完全展开,顶芽刚刚露出时,利用4000mg/L的卡那霉素溶液处理顶芽效果最佳。(4)花序点滴法主要影响因素对百日草转化效果分析。通过处理不同发育时期的花序和利用不同浓度的农杆菌重悬液处理蕾3时期花序以获得转化后代。实验表明:(1)通过利用1/2MS+Silwet L-77(0.05%v/v)+蔗糖(5%w/v)+6-BA(0.01mg/L),OD600=0.8,p H=5.8的点滴液处理花1、蕾3、蕾5时期的百日草花序,结果均未得到转化后代。(2)利用不同配置浓度的农杆菌重悬液处理百日草S5蕾3时期的花序,得出浓度为1/2MS+Silwet L-77(0.03%)+蔗糖(10%)+6-BA(0.01mg/L),OD600=0.8和1/2MS+Silwet L-77(0.03%v/v)+蔗糖(15%w/v)+6-BA(0.01mg/L),OD600=0.8的农杆菌重悬液处理组合获得了阳性株,阳性比率分别为0.35%和0.31%。(5)花粉管通道法转化分析。利用浓度为100ng/μL、150ng/μL和200ng/μL的外源DNA分别以切除柱头的方法和柱头保留的方法,在授粉后的1h、2.5h、4h分别处理,得出切除柱头的处理方式导致结实率显著降低,柱头保留仅授粉一次得到与对照相近的结实率,但两种处理方式均未得到转化后代。
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