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目的高通量培养组对肠道菌群的培养取得了巨大的进步,采用这种方法不仅能够培养出在传统培养基上能够生长的细菌,而且能够培养出了先前认为“不能培养”的多种细菌。而在采供血领域中如何有效地检测出受污染血小板中含有的细菌一直是个难题。因此,我们拟采用培养组的方法对血小板制品进行精确的检测,并达成以下目的:(1)利用微生物高通量培养组的方法建立一种细菌检测体系,并用此体系来检测受污染血小板样本中存在的细菌,以此来提高血小板中细菌的检出率。同时应用宏基因组高通量测序对上述检测体系进行验证。(2)使用16S rRNA一代测序、16S深度测序对接种样本培养后的细菌种属进行鉴定;采用高通量宏基因组直接对血小板样本中的细菌种属进行鉴定,三种方法综合分析,最终确定血小板中含有的细菌,并对结果进行分析。方法(1)采用培养组中的有氧条件下的8种液体培养基替代传统的1种培养基,对采集的血小板样本接种到液体培养基进行预培养,并把培养液定期在血琼脂平板上均匀涂布,分离出单个菌株并扩增出该细菌的16S rRNA基因片段后采用Sanger测序的方法进行碱基测定;对测序后的结果采用NCBI网站上的BLAST进行比对,鉴定出细菌的种属。(2)对预培养中的液体培养基进行混样,用无菌PBS溶液对血琼脂平板上的细菌冲洗后进行混样,之后对两个混样样本分别做16S深度测序,采用生物信息学的方法对测序结果进行分析并鉴定细菌的种属。(3)对血小板样本进行超速离心后,提取总DNA,建库上机后宏基因组测序,所得数据用本课题组自有软件KrakenPy 1.0进行数据分析并鉴定其中细菌种属;(4)宏基因组测序结果和培养组的结果相互验证,确定出导致血小板污染的细菌种类,并对鉴定出的细菌进行分析。结果(1)建立起检测血小板中细菌的培养体系及后续通过Sanger测序后用BLAST鉴定菌种,用此方法鉴定出此批次受污染血小板样本中存在芽孢杆菌(Bacillus sp.)、赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sp.)、郭霍氏芽孢杆菌(B.kochii)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)、黄原胶降解菌(P.lautus)、葡萄球菌(Staphylococcus sp.)、马胃葡萄球菌(S.equorum)、红球菌(Rhodococcus sp.)。(2)采用16S深度测序共得到166,678条Raw Tags,质控后得到161,827条Clean Tags,其中预培养(液体培养基)得到82,227条Clean Tags,传代培养(固体培养基)得到79,600条Clean Tags;最终鉴定出预培养中丰度较高的菌种为芽孢杆菌(Bacillus sp.)、葡萄球菌(Staphylococcus sp.)、乳杆菌(Lactobacillus sp.)、类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)和传代培养中丰度较高的菌种为类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)、葡萄球菌(Staphylococcus sp.)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)、Turicibacter、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)。(3)通过宏基因组测序产出Raw data共72.22 G,质控后得到Clean data共54.53 G,结果显示丰度较高的主要为厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)。其中鉴定出细菌种类最多的是厚壁菌门(Firmicutes),细菌种类主要包括:苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)、胶质类芽孢杆菌(P.mucilaginosus);其次为变形菌门(Proteobacteria),主要包括:赭黄嗜盐囊菌(Haliangium ochraceum)、嗜麦芽寡养单胞菌(S.maltophilia);还有放线菌门(Actinobacteria),主要包括红平红球菌(R.erythropolis)、银色棒杆菌(Corynebacterium argentoratense)。(4)培养组与宏基因组测序结果相互验证后,发现两种方法都检测出的细菌为蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、类芽胞杆菌(Paenibacillus sp.)、红平红球菌(R.erythropolis)。宏基因组和培养组学中都出现且丰度较高的细菌最可能为受污染血小板中的细菌,结果显示蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)和红平红球菌(R.erythropolis)三种细菌最可能是此批次血小板的污染菌,蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)一般为皮肤菌群,提示者两种菌可能来自皮肤,这也说明了采集血小板时对献血者和采血者的皮肤消毒都非常重要。另一方面检测出的红球菌的来源尚未明确,至于来自何处后续需要进一步回溯。另外,宏基因组检测出的细菌种类也要多加防范。结论建立起了微生物培养与高通量测序及后续数据处理的流程,微生物培养组、16S rRNA基因一代测序、16S深度测序和宏基因组测序三种技术手段从不同的角度对血小板中的细菌进行检测并相互印证,最终可以精确的确定出血小板中含有的菌类,这为高灵敏地检测出血小板制品中的细菌提供了新的思路,也为以后研发更为自动化的培养组检测系统做了初步探索。通过微生物培养组结果与宏基因组结果对比分析,高通量测序中检测出但没有培养出的变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)为血小板样本中可能存在的细菌,这些信息也为改进培养组从而更广泛检测血小板制品中的细菌提供了参考方向。