论文部分内容阅读
蛇毒中含有许多有用组分,近年来,质谱技术和高通量测序技术的不断发展加快了对蛇毒组分的剖析进程。和传统的技术相比,最新的测序平台可以对更多的蛇毒组分进行分析。蛇毒腺的高通量测序可以从mRNA水平了解样品中所转录的基因,除了获得毒素蛋白质,也能够检测出非酶毒素成分的信息。基于串联质谱法的蛇毒蛋白质组学研究依赖于已有蛋白质序列数据库的信息量,但可从另一个侧面验证高通量测序的结果,二者互为补充,将两者结合起来从全局的角度探索蛇毒素蛋白具有重大意义。中介蝮(Gloydius intermedius)属于蝰科(Viperidae)蝮亚科(Crotalinae)亚洲蝮属(Gloydius),是我国6种蝮蛇中毒性最强的一种,广泛分布于我国西北及华北地区。为了了解中介蝮的毒素全貌,本研究采用IlluminaHiseq2500高通量测序技术结合LC-MS/MS技术对中介蝮毒腺转录组和蛋白组进行了分析。主要结果如下:1、中介蝮毒腺转录组分析(1)利用BlastX程序将中介蝮毒腺转录组组装得到的19821条Unigene对NR蛋白数据库进行搜索,10547个Unigene得到功能注释,其中编码毒素蛋白的Unigene有27个,分别归属为10个毒素家族,金属蛋白酶(MP)6个,磷脂酶A2(PLA2)6个,蛇毒C型凝集素样蛋白(CTLP)4个,丝氨酸蛋白酶(SP)3个,三指毒素(3FTx)3个,透明质酸酶(Hydase)、磷酸二酯酶(PDE)、富含半胱氨酸的分泌蛋白(CRISP)、L-氨基酸氧化酶(L-AAO)以及神经生长因子(NGF)各1个。(2)按照RPKM值所揭示的表达丰度,毒素表达水平从高到低的排序依次为:PLA2 家族(82435.79)>SP 家族(30758.48)>CTLP 家族(6562.87)>L-AAO 家族(6347.89)>NGF 家族(4857.31)>CRISP 家族(1204.57)>MP 家族(1020.96)。其余低表达的毒素包括 PDE 家族(191.29)>Hydase 家族(148.39)>3-FTx 家族(27.93)。(3)对新获得的9个Gisps基因的序列进行的氨基酸序列分析表明,Gisp1和Gisp3属于激肽原酶(Kininogennase,KN)型丝氨酸蛋白酶;Gisp2属于蛋白酶C激活剂(C-protein activator,PCA)型;Gisp4 和 Gisp5 属于凝结酶(Cogulating enzymes,CL)型;Gi-PA1-4 属于纤溶酶原激活剂(plasminogen activators,PA)型。(4)实时定量PCR分析表明,中介蝮9个Gisps的相对表达量由高到底依次为:Gisp1>Gi-PA1>Gisp2>Gi-PA2>Gisp3>Gi-PA3>Gisp4>Gi-PA4>Gisp5。2、中介蝮毒素蛋白组分析采用LC-MS/MS技术对中介蝮粗毒样品进行鉴定,结果表明共有1146条肽段匹配到10个毒素家族,即510,356,192,27,26,12,12,7,2,2条肽段分别匹配到SP,LAAO,PLA2,MP,CTLP,CRISP,BPP-CNP,PDE,Hydase和NGF等毒素家族。值得注意的是,未发现PLB和3-FTx家族的肽段。比较转录组和蛋白组分析结果,可以看出SP、LAAO和PLA2是表达量最高的3个毒素家族。3、中介蝮丝氨酸蛋白酶的分离纯化及活性测定由于丝氨酸蛋白酶是中介蝮毒素中表达量较高的家族之一,该家族在医药领域有广泛的应用,尤其是在心血管疾病治疗方面。本研究在上述组学研究的基础上,通过凝胶过滤层析及阴离子交换层析对其粗毒进行了分离纯化,得到丝氨酸蛋白酶组分,利用特定底物对其活性分析进行了测定,利用SDS-PAGE分析了丝氨酸蛋白酶在每个组分中的含量,结果如下:(1)利用凝胶过滤层析介质Sephacryl-200HR对中介蝮粗毒进行了分离得到6个组份,用小分子合成多肽底物BApNA检测丝氨酸蛋白酶活性,发现丝氨酸蛋白酶活性主要分布在P3组分,该组分为混合物,需要做进一步分离。(2)利用阴离子交换层析介质HiTrap DEAE FF对P3组分进行了进一步分离得到5个蛋白组份(P3-1～P3-5)。以4个合成发色肽(B7632、T1637、B2133、V7127)为底物检测发现:分离得到的5个组分(P3-1～3-5)的类激肽释放酶活性都比较低;P3-1和P3-2都显示出较高的凝血酶活性及类凝血酶活性,而纤溶酶活性及类激肽释放酶活性较低;P3-3具有较高的纤溶酶活性及凝血酶活性;对5个组分中丝氨酸蛋白酶所在位置(26kDa～35kDa)的分析意外的发现:P3-1和P3-2中丝氨酸蛋白酶相对含量较高但丝氨酸蛋白酶活性较低,而P3-3中丝氨酸蛋白酶含量相对较低,但是丝氨酸蛋白酶活性较高;P3-4和P3-5对四种底物都没有明显的水解活性。表明P3-4和P3-5中几乎不含有丝氨酸蛋白酶。结合对9种Gisps的理化性质的预测结果,推测 Gisp3、Gisp4、Gisp5 分布在 P3-1 中,Gisp1 分布于 P3-2 中,Gi-PA1、Gi-PA2、Gi-PA3 分组在 P3-3 中,Gi-PA4 分布于 P3-1 或 P3-2 当中。结论:(1)在亚洲蝮属的6个物种中,中介蝮毒素中表达的PLA2神经毒素最高,而其他大多数亚洲蝮主要含有出血性的毒素。和响尾蛇类似,本研究在亚洲蝮毒素中发现了毒素进化的二态现象。同时还发现亚洲蝮毒素中存在神经毒素与降血压组分(如KN-type SP和BPP-CNP)的共进化趋势。(2)在中介蝮蛇毒中只存在P-ⅢMP而没有P-Ⅰ和P-ⅡMP.获得了 9个丝氨酸蛋白酶家族成员。Gisp1和Gisp3为KN型,Gisp2为PCA型,Gisp4和Gisp5为CL型,Gi-PA1-4属于PA型丝氨酸蛋白酶。(3)除CRISP和Hydase,大部分中介蝮毒素的氨基酸序列与其他蝮蛇或者响尾蛇有高度的相似性(>90%)。蛇毒素的快速进化主要表现在一些关键毒素家族的表达水平差异以及新型毒素蛋白,而不是影响编码序列的点突变。