研究背景乳腺癌(Breast cancer,BC)发病率日益增高,也是全球女性癌症死亡的主要原因。乳腺癌发生发展机制尚不明确,细胞增殖和凋亡抑制是治疗面临的难点,同时,化疗耐药以及因为耐药引发的难治性疾病也是综合治疗面临的一个特别的挑战。P53基因(肿瘤抑制蛋白p53)是与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因,可诱导p21、CDKN1A、BTG2和BAX等基因表达,通过抑制细胞周期依赖激酶来抑制细胞周期进展,也可以通过线粒体途径促进细胞凋亡。如果抑癌蛋白p53失活或突变,细胞增殖进展失控,细胞凋亡的执行力也会大大降低。此外,p53介导的通路可以被基因毒性化合物激活,如化疗药物顺铂,从而引起肿瘤细胞周期阻滞和细胞凋亡。因此,p53功能的激活被认作是癌症的治疗靶点,其蛋白稳定性的维持对于其抑癌功能的正常发挥具有重要意义。约70%的乳腺癌病例中存在野生型p53,在这些病例里,p53的功能活性对于指导治疗及预后都起着非常重要的作用。目前,除了点突变和基因缺失外,翻译后蛋白修饰异常已被证实是p5 3失活的重要机制。在这些翻译后修饰中,泛素蛋白酶体系统(Ubiquitin proteasome system,UPS)是体内最主要的蛋白质降解途径之一。令人惊喜的是,去泛素化酶(deubiquity lase,DUBs)可逆转泛素化过程、介导底物蛋白(如p53)去泛素化并稳定其蛋白水平。在乳腺癌中,越来越多的异常表达的去泛素化酶(DUBs)被发现,包括有肿瘤促进作用的DUBs和肿瘤抑制作用的DUBs。然而,只有两种DUBs被证明能够在乳腺癌中去泛素化并稳定p53。因此,调控p53去泛素化的相关机制亟待进一步研究。OTU去泛素酶3(OTUD3)定位于人类染色体1p36.13,是一个迄今研究极少的基因。动物实验证实OTUD3可能特异性促进肺癌的发生,而抑制乳腺癌发生。然而,OTUD3在恶性肿瘤发生发展中的作用值得进一步研究,其与乳腺癌发生发展的关系、以及是否可以作为乳腺癌的治疗靶点也值得进一步探索。我们前期研究发现,OTUD3可以去泛素化并稳定PTEN。然而与PTEN相比,OTUD3和p53的低表达水平更能提示乳腺癌预后不良。本课题不仅检测了 OTUD3在乳腺癌与癌旁组织中的表达,而且同时检测了 OTUD3与p53表达的相关性,鉴于乳腺癌细胞增殖及凋亡过程中OTUD3同p53所起到的调控作用未见报道,因此我们在存在野生型p53的乳腺癌细胞系中进行了细胞增殖实验和凋亡实验,以及泛素化实验、免疫共沉淀等研究,进一步验证了OTUD3泛素化酶活性对乳腺癌细胞增殖及诱导凋亡的重要意义,及其对p53的正向调控作用。总之,本文初步探索了 OTUD3在乳腺癌中的表达及与p53的关系,以及OTUD3相关生物学功能和机制,以期对乳腺癌的诊断和治疗提供了新思路和方向。研究目的:研究去泛素化酶OTUD3是否是乳腺癌发生发展过程中的重要抑癌因子;研究OTUD3去泛素化酶活性对野生型p53乳腺癌细胞的生物学功能;研究OTUD3去泛素化修饰p53,调节p53蛋白稳定性的分子机制。研究方法:(1)利用TCGA数据集在线分析OTUD3mRNA和蛋白在人乳腺癌组织中的表达情况,以及抑癌基因OTUD3、p53和PTEN与患者预后的关系。(2)收集山东大学齐鲁医院(青岛)乳腺癌肿瘤组织标本和对应癌旁组织标本共80对,通过免疫组化方法检测OTUD3表达,分析其表达与齐鲁队列乳腺癌临床病理特征之间的关系,验证OTUD3表达与乳腺癌的发生、进展、分子分型、侵袭和转移的关系。(3)收集乳腺癌及癌旁正常组织新鲜标本26对,免疫印迹(Western Blot,WB)检测癌组织与癌旁组织中OTUD3、p53和p21的蛋白水平,确证OTU-D3表达与肿瘤细胞组织学分级的关系,并分析OTUD3表达与p5 3/p21表达的相关性。(4)通过MTS增殖试验对分别转染OTUD3、OTUD3C76A的MCF7和DU4475细胞与阴性对照细胞株的增殖速率进行检测;构建OTUD3敲低的MCF7和DU4475细胞稳定株,通过MTS增殖试验试剂盒和酶标仪对细胞增殖速率进行检测,分别回转过表达不受shRNA干扰的OTUD3和酶活性突变体OTUD3C76A后,对细胞增殖速率进行检测。(5)通过克隆形成实验对分别转染OTUD3、OTUD3C76A的MCF7和DU4475细胞与阴性对照细胞株的生长速度进行检测;构建OTUD3敲低的MCF7和DU447 5细胞稳定株,通过克隆形成实验对细胞生长速度进行检测,分别回转过表达不受shRN A干扰的OTUD3和酶活性突变体OTUD3C76A后,通过克隆形成实验对细胞生长速度分别进行检测。(6)使用化疗药物顺铂处理分别转染OTUD3、OTUD3C76A的MCF7和DU4475细胞与阴性对照细胞株,通过凋亡试剂盒检测细胞对顺铂诱导的细胞凋亡的敏感性。构建OTUD3敲低的MCF7和DU4475细胞稳定株,通过凋亡试剂盒检测细胞对顺铂诱导的细胞凋亡的敏感性,分别回转过表达不受shRNA干扰的OTUD3和酶活性突变体OTUD3C76A后,检测细胞凋亡率的变化。(7)使用野生型p53乳腺癌细胞株MCF-7和DU4475,分别转染Flag-OTUD3过表达OTUD3,以Flag空载体作为阴性对照,采用WB检测p53,p21和BAX的蛋白水平。(8)使用野生型p53乳腺癌细胞MCF-7和DU4475,通过OTUD3 shRNA或Control shRNA慢病毒转染细胞下调OTUD3后,采用WB检测p5 3,p21和BAX的蛋白水平;使用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞后,采用WB检测p53,p2 1和BAX的蛋白水平。(9)OTUD3 shRNA转染细胞下调OTUD3后,应用蛋白质合成抑制剂放线菌酮(CHX)处理细胞,与对照组细胞及回转过表达OTUD3组相比,于相应时间点采用WB检测p53的蛋白水平。(10)MCF7细胞和DU4 475细胞中分别转染Myc-MDM2过表达MDM2,以Myc空载体作为阴性对照,WB检测细胞内源p53水平;同时分别转染Flag-OTUD3过表达OTUD3,采用WB检测p53的蛋白水平;(11)运用免疫共沉淀实验测定OTUD3与p53是否存在相互作用;(12)构建OTUD3截短体及相应真核表达载体(Myc-OTUD3、Myc-D1、Myc-D2)、构建p53截短体及相应真核表达载体(Myc-p53、Myc-T1、Myc-T2、Myc-T3、Myc-T4),进行免疫共沉淀实验,寻找两者相互作用的区域;(13)分别构建带GST标签的p53原核表达载体和带GST标签的OTUD3原核表达载体,通过GST-pu1ldown实验检测OTUD3与p53是否存在直接相互作用,并再次验证了两者相互作用的区域;(14)MCF7 细胞和 DU4475 细胞中分别转染 OTUD3shRNA,以 Control shRNA作为阴性对照,转染后48h加入蛋白酶体抑制剂MG1 32处理以抑制蛋白的降解,通过泛素化实验检测细胞内源p53的泛素化水平;再分别转染Flag-OTUD3,Flag-OTUD 3C76A相Myc-MDM2,MG132处理细胞,再次检测细胞内源p53的泛素化水平。研究结果1.在线分析OTUD3在乳腺癌中的表达情况在线分析人类乳腺癌TCGA数据库的UALC AN基因表达数据平台,分析结果显示,乳腺癌组织中OTUD3mRNA水平明显低于正常乳腺组织(p<1E-12);其mRNA水平表达和乳腺癌临床分期无关;可能与分子分型有关:在三阴性乳腺癌(TNBC)中略高于Her-2阳性型(p=0.0337),但在Lumina1型与Her-2阳性型中表达(p=0.0714)无差异、在Lumina1型与TNBC中表达(p=0.105)也无差异。乳腺癌组织中OTUD3蛋白表达水平明显低于正常乳腺组织(p=0.0023);其蛋白表达水平和分子分型无关,可能和分期有关:在早期1期(p=0.1743)乳腺癌组织与癌旁组织中表达无差异,但在2期(p=0.0030)、3期(p=0.0099)乳腺癌组织中表达均低于正常组织,且在2期乳腺癌组织中表达高于3期(p<1E-12)。2.在线分析各抑癌分子与乳腺癌预后的关系采用Kaplan-Meier生存在线分析OTUD3表达、p53表达和PTEN表达与乳腺癌患者生存的关系。结果提示,OTUD3高表达组(n=1 986)的RFS率好于 OTUD3 低表达组(n=1 965)(p=0.00034)。同样,p53 高表达组(n=1 977)的RFS率优于低表达组(n=1974)(p=0.00054)。然而,PTEN的表达水平并不是乳腺癌患者的独立预后因素(p=0.62)。结果提示相比PTEN而言,OTUD3和p53的表达与乳腺癌患者预后有关,高表达OTUD3或p53的乳腺癌患者预后好。3.齐鲁队列乳腺癌组织中OTUD3表达与临床病理特征的关系利用本中心数据进行在线分析数据的验证。免疫组化结果显示,齐鲁队列乳腺癌组织中,OTUD3的蛋白表达水平显著低于乳腺癌癌旁正常组织,并且与分子分型和临床分期均无关,但提示可能与肿瘤细胞组织学分级有关:3.1乳腺癌组织中OTUD3的表达与乳腺癌细胞组织学分级的关系:OTUD3蛋白表达与肿瘤细胞组织学分级有关(χ2=7.424),差别具有统计学意义(p=0.024);3.2乳腺癌组织中OTUD3的表达与肿瘤大小的关系:OTUD3蛋白表达与乳腺癌原发肿瘤大小无关(χ2=0.120),差别无统计学意义(p=0.942);3.3乳腺癌组织中OTUD3的表达与腋窝淋巴转移的关系:OTUD3蛋白表达与淋巴结转移个数无关(χ2=3.963),差别无统计学意义(p=0.265);3.4乳腺癌组织中OTUD3的表达与临床分期的关系:OTUD3蛋白表达与临床分期无关(χ2=6.070),差别无统计学意义(p=0.1 94);3.5乳腺癌组织中 OTUD3 的表达与ER,PR,Her-2,Ki67的关系:OTUD3 蛋白表达与 ER,PR,Her-2,Ki67 分子分型无关(χ2=0.131/3.418/4.940/0.491),差别均无统计学意义(p=0.7 1 7/0.06 4/0.0 26/0.483);3.6乳腺癌组织中OTUD3的表达与分子分型的关系:OTUD3蛋白表达与分子分型无关(χ2=7.292),差别无统计学意义(p=0.1 21);3.7乳腺癌组织中OTUD3的表达与年龄的关系:OTUD3蛋白表达与年龄无关(X2=1.054),差别均无统计学意义(p=0.305)。4.OTUD3与p53、p21表达呈正相关采用WB检测,结果提示OTUD3和p5 3在乳腺癌组织及癌旁正常组织中均有表达,并且OTUD3蛋白表达水平与p5 3蛋白表达水平呈显著正相关(r=0.8849,p<0.0001),OTUD3蛋白表达水平与p53下游p21蛋白表达水平呈正相关(r=0.6 42 7,p<0.0 00 1)。5.OTUD3通过去泛素化修饰p53抑制野生型p53乳腺癌细胞增殖在表达野生型p53的乳腺癌细胞MCF7(Luminal型)和DU4475(三阴性)细胞中过表达OTUD3后,MCF7和DU4475细胞增殖速率减慢,而过表达其酶活性突变体OTUD3C76A可导致细胞增殖速率加快。MCF-7和DU4475细胞中稳定敲低OTUD3,细胞增殖速率均显著快于阴性对照。然而,回转过表达不受shRNA干扰的OTUD3后,MCF-7和DU4475细胞增殖速率明显减慢;回转酶活性突变体OTUD3C76A后细胞增殖速率均无显著变化。6.OTUD3通过去泛素化酶修饰p53抑制野生型p53乳腺癌细胞克隆形成MCF-7和DU4475细胞中分别转染OTUD3后,细胞克隆形成能力减弱,然而,分别转染酶活性突变体OTUD3C76A,细胞克隆形成能力增强。MCF-7和DU4475细胞中稳定敲低OTUD3后,细胞克隆形成能力显著增强。然而,回转过表达不受shRNA干扰的OTUD3后,细胞克隆形成能力显著减弱;回转酶活性突变体OTUD3C76A后细胞细胞克隆形成能力显著增强。7.OTUD3通过去泛素化修饰p53影响顺铂诱导的乳腺癌细胞凋亡OTUD3转染细胞后,细胞对顺铂诱导的凋亡敏感性显著升高;但转染OTUD3C76A后细胞对顺铂诱导的凋亡敏感性显著下降。与阴性对照细胞相比,OTUD3稳定敲低细胞对顺铂诱导细胞凋亡敏感性显著下降。分别在OTUD3稳定敲低的MCF-7和DU44 75细胞中回转不受shRNA干扰的OTUD3,细胞的凋亡比例显著回升,而回转OTUD3C76A,细胞凋亡比例进一步下降。8.OTUD3正向调节p53蛋白稳定性在MCF-7和DU4475细胞中分别过表达OTUD3,WB检测提示p53及下游p21和BAX蛋白水平升高,敲低OTUD3,p53及下游p21和BAX蛋白水平显著下降,而MG132处理细胞抑制蛋白酶体功能后,p53及下游p21和BAX蛋白水平回升。在p53蛋白半衰期实验中:敲低OTUD3,p53半衰期缩短;回转OTUD3,p53半衰期得以延长。过表达MDM2,p53蛋白水平下降;同时转染OTUD3后p53蛋白水平得以挽救。9.OTUD3与p53相互作用选用表达野生型p53的Luminal型MCF7细胞和三阴性DU4475细胞,分别制成细胞裂解液,进行免疫共沉淀实验(CoIP)和交互作用实验,证实OTUD3与p53之间存在着体内相互作用。构建OTUD3截短突变体,通过截短体CoIP实验发现OTUD3和D1截短体均可与p53相互作用,且两者与p53的结合能力无显著差异,表明OTUD3分子中的OTU结构域介导了其与p53的相互作用;构建p53截短突变体,通过截短体CoIP实验发现p53及T2和T3截短体均可与OTUD3相互作用,但是T1和T4截短体不能与OTUD3结合,证明p53的转录激活域和C末端介导了其与OTUD3相结合。通过截短体GST pull-down实验检测OTUD3与p53的相互作用方式。结果提示OTUD3的OTU结构域能够与p53的转录激活域和C末端发生直接相互作用,再次验证了截短体CoIP实验的结果,进一步表明OTUD3与p53之间的相互作用为直接相互作用。10.OTUD3稳定p53依赖于其去泛素化酶活性敲低OTUD3能够使p5 3泛素化水平明显升高。单独过表达MDM2时,p53泛素化水平较高,同时过表达OTUD3,能有效拮抗MDM2引起的p53泛素化水平升高,然而,当诱导表达OTUD3酶活突变体Flag-OTUD3C76A,p53泛素化水平没有降低,即酶活性突变体OTUD3C76A并不能拮抗MDM2对p53的泛素化作用。研究结论:OTUD3是乳腺癌的一个重要抑癌蛋白,是p53的一个重要去泛素化酶,对野生型p53乳腺癌细胞有重要的生物学功能。1.OTUD3在乳腺癌中表达降低,其表达水平与临床分期、分子分型和肿瘤细胞组织学分级无关。2.OTUD3可作为乳腺癌的独立预后因素,OTUD3高表达的乳腺癌患者预后好于低表达的患者。3.在人乳腺癌组织中,OTUD3与p53及p53下游p21的表达呈高度正相关。4.OTUD3可以抑制野生型p53乳腺癌细胞细胞增殖,抑制细胞克隆形成并增加细胞对顺铂诱导的细胞凋亡敏感性。其对细胞生物学功能的影响依赖于其去泛素化酶活性。5.OTUD3是p53的去泛素化酶,能够维持p53蛋白的稳定性。能够直接与p53发生相互作用,介导二者相互作用的区域分别是OTUD3的OTU结构域和p5 3的转录激活域与C末端。研究意义:进一步补充完善了乳腺癌中p53的去泛素化酶研究。