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目的:成骨不全（osteogenesis imperfecta）是一种以骨脆性增加、骨结构异常为临床特征的遗传性疾病,目前临床治疗以手术矫正为主,但是多次手术给患者带来极大痛苦。在所有成骨不全分类中,Ⅰ型成骨不全发病率最高,由COL1A1基因单倍剂量不足导致Ⅰ型胶原蛋白含量降低引起。Ⅰ型胶原蛋白的改变会影响骨发育相关通路,但具体分子机制尚不明确。目前已有的小鼠模型Mov13虽然Ⅰ型胶原蛋白表达降低,但是与临床病人胶原蛋白水平降低的机制不同,同时该小鼠模型会出现表型减退的现象。因此,本研究拟采用CRISPR/Cas9技术构建从致病机制到表型更加接近Ⅰ型成骨不全的小鼠模型,研究Ⅰ型胶原蛋白降低影响小鼠骨形成的机制,并在此基础上寻找安全有效的治疗方法,为临床成骨不全治疗提供新的方法和思路。方法:（1）采用CRISPR/Cas9技术将小鼠col1a1基因25外显子敲除,构建Ⅰ型成骨不全小鼠模型;采用PCR及琼脂糖凝胶电泳对小鼠基因型进行鉴定,将Ⅰ型成骨不全小鼠命名为col1a1+/-365。（2）分别取col1a1+/-365小鼠以及同窝野生型小鼠股骨、皮肤、肾脏和外周血血清;采用定量real-time PCR（quantitative real-time PCR,q PCR）检测股骨、皮肤和肾脏中Col1a1转录水平;采用Western blot检测股骨中Col1a1蛋白水平;采用苏木精&伊红（H&E）染色检测股骨远端骨生长情况;采用天狼猩红染色检测股骨和皮肤中Ⅰ型胶原蛋白分布情况;采用免疫组化染色检测肾脏中Ⅰ型胶原蛋白表达情况。（3）采用Micro-CT检测股骨微观结构;采用三点弯曲方法检测股骨力学特征;采用双能X射线吸收法（dual energy X ray absorptiometry,DXA）检测小鼠骨密度和骨矿物质含量;采用ELISA检测col1a1+/-365小鼠和野生型小鼠血清中骨生成指标Ⅰ型前胶原氨基端原肽（type I procollagen N-terminal propeptide,PINP）和骨代谢指标Ⅰ型前胶原羧基端原肽（C-terminal telopeptide of type I collagen,CTX-I）含量。（4）采用RNA-seq寻找野生型小鼠和col1a1+/-365小鼠脂肪来源间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs）的差异表达基因,根据差异基因检测结果分别对其GO（Gene Ontology）功能和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）生物通路进行分类及富集分析。（5）采用划痕实验和Transwell检测ADSCs迁移能力,采用q PCR检测ADSCs中Sdf-1表达水平,采用ELISA检测小鼠血清中SDF-1蛋白水平;采用q PCR、碱性磷酸酶（alkaline phosphatas,ALP）染色和ALP活性测定检测ADSCs成脂和成骨分化能力。（6）采用q PCR检测col1a1+/-365小鼠股骨中成骨分化指标Runx2和Osterix m RNA水平,采用Western blot检测股骨中骨钙素（bone gla protein,Bglap）蛋白水平,采用免疫组化染色检测股骨中Bglap表达。（7）采用Western blot检测股骨中hippo通路关键因子YAP表达水平,采用q PCR检测YAP靶基因Ctgf和Cyp61转录水平;采用细胞免疫染色检测YAP核定位变化;通过在培养皿中预铺Ⅰ型胶原方法给ADSCs补充胶原,观察YAP核定位变化。（8）采用透射电镜检测纳米羟基磷灰石形貌和粒径,采用MTS法对纳米羟基磷灰石进行毒性检测;采用q PCR和ALP染色检测纳米羟基磷灰石诱导ADSCs成骨分化的作用。将纳米羟基磷灰石与基质胶混合,注射到col1a1+/-365小鼠骨髓腔,采用Micro-CT、DXA以及组织学分析对治疗效果进行评价。结果:（1）PCR及琼脂糖凝胶电泳结果显示野生型小鼠只出现一条1623bp大小的条带,col1a1+/-365小鼠出现两条带,分别为1623bp和594bp,说明Col1a1基因25外显子敲除成功。（2）与野生型小鼠相比,q PCR结果显示col1a1+/-365小鼠股骨、皮肤和肾脏中Col1a1表达量显著降低;Western blot结果显示col1a1+/-365小鼠股骨中Col1a1蛋白水平明显降低;H&E染色结果显示股骨骨小梁减少;天狼猩红染色结果显示col1a1+/-365小鼠股骨和皮肤中Ⅰ型胶原明显减少;免疫组化染色结果显示col1a1+/-365小鼠肾脏中Col1a1蛋白降低;以上结果初步说明模型构建成功。（3）与野生型小鼠相比,Micro-CT结果显示,col1a1+/-365小鼠股骨微观结构出现明显异常,承受的最大载荷应力和刚度均明显降低,骨密度和骨矿物质含量均显著降低,外周血中PΙNP水平明显降低,CTX-Ι水平显著升高;以上结果进一步说明模型构建成功。（4）RNA-seq检测共发现1287个差异表达基因,其中上调基因454个,下调基因833个,GO和KEGG分析结果显示,与细胞外基质、细胞运动、细胞分化相关的多条通路发生改变。（5）划痕实验和Transwell结果显示col1a1+/-365小鼠ADSCs迁移能力显著降低,q PCR结果显示col1a1+/-365小鼠ADSCs Sdf-1表达明显下降,ELISA结果显示col1a1+/-365小鼠血清中SDF-1蛋白水平显著降低。（6）col1a1+/-365小鼠MSCs成脂分化能力升高,成骨分化能力降低;col1a1+/-365小鼠股骨中Runx2和Osterix m RNA表达明显降低,Bglap蛋白水平降低。（7）col1a1+/-365小鼠股骨中YAP蛋白水平显著降低,且其靶基因Ctgf和Cyp61表达量明显下调;将野生型小鼠和col1a1+/-365小鼠ADSCs进行成骨诱导后,col1a1+/-365小鼠ADSCs YAP入核降低,补充Ⅰ型胶原后YAP入核增多。（8）纳米羟基磷灰石（nano-hydroxyapatite,n HA）粒径较小,0.2 mg/m L浓度时对细胞无明显毒性,同时可以诱导MSCs成骨分化;将包裹纳米羟基磷灰石的基质胶注射到col1a1+/-365小鼠骨髓腔中,8周后骨量增加、骨密度升高、骨钙素表达增加。结论:1、本研究构建的col1a1+/-365小鼠Ⅰ型胶原蛋白含量降低、骨量降低、股骨力学性能下降,符合Ⅰ型成骨不全临床特征;2、col1a1+/-365小鼠Ⅰ型胶原减少导致ADSCs迁移能力降低,血清中SDF-1水平降低,可能影响间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）向骨组织的迁移及骨形成;3、col1a1+/-365小鼠ADSCs成骨分化能力降低可能是Ⅰ型胶原蛋白降低导致YAP入核减少导致;4、纳米羟基磷灰石联合基质胶骨髓腔内注射有望成为治疗Ⅰ型成骨不全的有效方法。