【摘 要】
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目的:探讨黄连素(Berberine,BBR)对氧糖剥夺/复氧(Oxygen Glucose Deprivation/reoxygenation,OGD/R)模拟的缺血再灌注所致PC12细胞损伤的保护作用及分子机制。方法:(1)蛋白
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目的:探讨黄连素(Berberine,BBR)对氧糖剥夺/复氧(Oxygen Glucose Deprivation/reoxygenation,OGD/R)模拟的缺血再灌注所致PC12细胞损伤的保护作用及分子机制。方法:(1)蛋白免疫印迹技术(Western blot)和流式细胞术筛选建立OGD/R模型;(2)CCK-8(Cell Counting Kit-8)试剂盒筛选BBR的有效工作浓度;(3)Hoechest33258染色观察OGD/R和BBR对OGD/R所致PC12细胞损伤的保护作用;(4)流式细胞术检测各组(Ctrl、OGD/R和OGD/R+BBR)细胞凋亡及活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的变化;(5)蛋白免疫印迹技术和免疫荧光术分析各组(Ctrl、OGD/R、OGD/R+4-PBA和OGD/R+BBR)细胞内质网应激及凋亡相关分子GRP78、CHOP、Bax、C-caspase3等的变化;(6)免疫印迹检测各组(Ctrl、OGD/R、OGD/R+3-MA和OGD/R+BBR)细胞并分析其自噬及凋亡分子P-m TOR/m TOR、P62、Beclin-1、LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ、BAX、C-caspase3等的表达变化;(7)自噬双标腺病毒(GFP-RFP-LC3)感染各组细胞后激光共聚焦显微镜分析其自噬流变化。结果:(1)免疫印迹和流式细胞术成功筛选建立OGD/R细胞模型的时间段为氧糖剥夺4小时+复氧18小时(OGD4+R18),细胞的凋亡和ROS水平升高最显著(P<0.05);(2)CCK-8结果显示,在0.1-50μM浓度范围内,BBR可以促进PC12细胞的存活,100μM浓度时细胞的存活率下降50%左右,接近IC 50值,差异具有显著性(P<0.05);(3)OGD4小时后给与不同浓度的BBR共同培养18小时,CCK-8检测细胞的存活率,结果显示BBR的最适工作浓度为5μM(P<0.05);(4)流式细胞术结果显示,BBR可显著降低OGD/R(OGD4+R18)导致的细胞凋亡和细胞内ROS水平的升高(P<0.05);(5)Hoechest33258染色实验的结果显示,较Ctrl组比较,OGD/R组细胞细胞核出现了高亮的蓝色,表明细胞凋亡显著增加,OGD/R+BBR组细胞核高亮蓝色的细胞数量减少,表明BBR可以降低细胞的OGD/R诱导的细胞凋亡;(6)蛋白免疫印迹和免疫荧光实验的结果显示较Ctrl组比较,OGD/R组内质网应激和凋亡相关分子GRP78、CHOP、Bax和C-caspase3的表达显著增加,内质网应激特异性抑制剂4-PBA和BBR显著降低了上述相关内质网应激和凋亡分子的表达(P<0.05);(7)免疫印迹实验结果显示较ctrl组比较,OGD/R组自噬标志分子LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例升高,P62和Beclin-1表达增加,经典的自噬通路m TOR通路的磷酸化表达水平降低,自噬特异性抑制剂3-MA和BBR均能显著降低LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例,降低P62和Beclin-1的表达,升高磷酸化m TOR的表达(P<0.05)。结论:(1)OGD/R诱导了PC12细胞内质网应激性或自噬性的细胞凋亡,其可能的分子机制是OGD/R诱导了细胞内持续性的ROS水平升高。(2)BBR可以显著降低OGD/R诱导内质网应激性细胞凋亡,其可能的机制是降低内质网应激相关分子GRP78和CHOP的表达,进降低凋亡相关分子Bax和C-Caspase3的表达;(3)BBR能够显著降低OGD/R诱导的自噬性细胞凋亡,其作用机制可能是升高磷酸化m TOR的表达,降低Beclin-1和P62的表达,降低LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例,改善功能障碍性的自噬流,进而保护细胞免于缺血再灌注诱导的损伤。
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