背景与目的:NLS-RARα是中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)切割早幼粒细胞白血病蛋白-维甲酸受体α融合蛋白(PML-RARA)所得。在前期的细胞和样本实验中,我们发现在APL细胞株和APL患者细胞中NLS-RARA皆在核中堆积。因此,本研究主要探究了NLS-RARA向核中堆积的转运机制。方法:1.构建NLS-RARα过表达慢病毒载体,分别感染入U937细胞和HL60细胞。400nmol/L1α,25-二羟基维生素D3(1α,25(OH)2D3)处理空载组(NC组)和NLS-RARα组(NR组)0,12,24,36,48小时。使用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)和免疫印迹(WB)法检测U937细胞和HL60细胞的CD11b,CD11c,CD14和CEBPβ的m RNA和蛋白表达水平变化。2.U937,HL60,NB4和293T细胞感染空载慢病毒和NLS-RARα过表达慢病毒,提取核浆蛋白,免疫印迹法(WB)和免疫荧光法检测NLS-RARα的核浆定位。3.NLS-RARα包含切割从PML处获得的NLS以及RARα自身的NLS。本研究中,突变切割ML所得的NLS,称为mut-1;突变RARα自身的NLS,称为mut-2;同时突变这两个NLS,称为mut-12。免疫印迹法和免疫荧光法检测各突变NLS-RARα的定位变化。免疫印迹法和q RT-PCR检测过表达突变的NLS-RARα的U937细胞经过1α,25(OH)2D3处理后,CD11b,CD11c,CD14和CEBPβ的m RNA和蛋白表达水平变化。4.急性髓系细胞系中KPNA2高表达,免疫荧光共定位检测NLSRARα和KPNA2和KPNB1的共定位情况。免疫共沉淀试验检测NLSRARα和KPNA2的相互作用情况。5.使用KPNA2和KPNB1的特异性抑制剂处理U937,HL60,NB4,293T细胞,采用免疫印迹法和免疫荧光法观察NLS-RARα的定位变化;使用脂质体转染,将KPNA2和KPNB1的小干扰RNA(si RNA)转染入293T细胞,采用免疫印迹法观察NLS-RARα的定位变化结果:1.免疫印迹试验和q RT-PCR结果显示,相比较空载组,NLS-RARα组的CD11b,CD11c,CD14和CEBPβ表达下降。2.免疫印迹法和免疫荧光法显示NLS-RARα主要位于细胞核中。3.免疫印迹法和免疫荧光法结果显示突变NLS-RARα的RARα区NLS,NLS-RARα的定位会由胞核转向胞浆。处于胞浆中的NLS-RARα对CD11b,CD11c,CD14和CEBPβ无影响。4.荧光免疫共定位和免疫沉淀法结果显示KPNA2,KPNB1和NLSRARα有相互作用。5.免疫印迹法和免疫荧光试验结果显示,敲低或者抑制KPNA2和KPNB1,NLS-RARα的定位会由胞核转到胞浆。结论1.NLS-RARα主要位于胞核中,并且抑制AML细胞的分化。2.NLS-RARα转运入核依赖RARα区的NLS。当NLS-RARα位于胞浆中,对AML细胞的分化无影响。3.NLS-RARα主要通过KPNA2/KPNB1途径入核。