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第一部分姜黄素对过氧亚硝酸盐损伤大鼠耳蜗螺旋神经节细胞的保护作用及机制研究实验目的：研究过氧亚硝酸盐(peroxynitrite, ONOO-)对大鼠耳蜗螺旋神经节细胞(spiral ganglion neuron, SGN)的氧化损伤作用,并进一步探讨姜黄素对对该损伤的保护作用及其机制。实验方法：体外原代培养大鼠耳蜗SGN细胞,采用免疫细胞化学荧光染色鉴定后进行后续实验。实验组施加姜黄素预处理,损伤组施加二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)预处理后分别加入ONOO-,正常对照组不做任何处理。四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞活性,Ho.33342和碘化丙啶(propidium iodide, PI)双染及流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测细胞凋亡,分光光度计检测细胞内谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性以及细胞内丙二醛(malonaldehyde, MDA)水平。RT-PCR分别检测Apaf-1、 Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2和Bax的mRNA表达,western blot分别检测SGN细胞线粒体和胞浆内Cytochrome c的含量,细胞内的活性Caspase-9、活性Caspase-3以及Bcl-2和Bax的蛋白表达。实验结果：过氧亚硝酸盐(100μM)作用于大鼠耳蜗SGN细胞24小时后,MTT结果显示细胞存活率降低至正常对照组的59.57-+3.02%,细胞凋亡率升高到正常对照组的50.27±3.26%(P<0.001),Ho.33342和PI染色显示ONOO-处理后的SGN细胞中出现了凋亡的细胞及少量的坏死SGN细胞。与损伤组相比,实验组姜黄素预处理减轻了IONOO-引起的SGN细胞损伤,对SGN细胞具有保护作用且该保护作用具有剂量和时间双重依赖性,15μM的姜黄素预处理12h使得细胞存活率升高至峰值,达到正常对照组的97.57±2.01%,细胞凋亡率降低至正常对照组的7.31±0.99%(P<0.001)。Ho.33342和PI染色进一步证实姜黄素预处理后ONOO-诱导的凋亡形态细胞明显减少,坏死细胞几乎消失。分光光度检测显示ONOO-(100μM)作用SGN细胞24h后,细胞的SOD活性和GSH含量分别降低至正常对照组的36.78±3.62%和45.15±7.03%,而MDA水平则上升至正常对照组的207.36±24.49%,姜黄素预处理可以提高细胞内SOD和GSH的水平分别至正常对照组的86.19±3.13%和116.47±1.75%,并且抑制了MDA水平的升高使其降低至正常组的85.04±：3.68%(P<0.01)。Western blot证实ONOO’引起了SGN细胞内Cytochrome c自线粒体释放入胞浆中并相应激活了Caspase-9、Caspase-3进而引起了SGN细胞凋亡,并且证明Bcl-2蛋白在此过程中表达降低而Bax蛋白表达升高。RT-PCR显示凋亡相关的基因Apaf-1、Caspase-9、Caspase-3和Bax的1nRNA水平在ONOO-损伤SGN细胞过程中表达升高,而Bcl-2的mRNA表达降低。另一方面,实验组中姜黄素预处理,阻止了ONOO-诱导的Cytochrome c由线粒体向胞浆的释放,抑制了Caspase-9和Caspase-3的激活并且消除了Bcl-2家族因子的表达改变,同时分别相应调节了()NOO‘引起的SGN细胞中Apaf-1、Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2和Bax基因的mRNA水平的变化。研究结论：本研究首次探讨了()NOO和姜黄素对耳蜗SGN细胞的协同作用。研究证明了ONOO-可以降低大鼠耳蜗SGN细胞的存活率,诱导其凋亡并发生氧化损伤,该损伤的机制可能与线粒体Caspase-依赖性的凋亡途径相关。另一方面,姜黄素可以减轻ONOO-引起的大鼠SGN细胞损伤作用,抑制其诱导的SGN细胞凋亡,该保护作用可能是通过抗氧化及保护细胞线粒体免于氧化应激的损伤的机制实现的。因此,姜黄素可作为潜在的抗氧化剂,在防治由于SGN细胞氧化损伤引起的感音神经性耳聋中发挥作用。第二部分凋亡诱导因子和核酸内切酶G核转位在过氧亚硝酸盐诱导大鼠耳蜗螺旋神经节细胞凋亡中的作用实验目的：研究过氧亚硝酸盐(peroxynitrite, ONOO")诱导大鼠耳蜗螺旋神经节细胞(spiral ganglion neuron, SGN)发生的非Caspase-依赖途径的凋亡,进一步探讨凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor, AIF)和核酸内切酶G (endonuclease G, Endo G)在该凋亡过程中的作用。实验方法：体外原代培养新生大鼠耳蜗螺旋神经节细胞,采用免疫细胞化学荧光染色鉴定SGN细胞,实验组加入Caspase广谱抑制剂Z-VAD-FMK预处理,损伤组加入DMSO预处理后,加入ONOO-(100μM)作用SGN细胞24h,正常对照组细胞不做任何处理。吖啶橙染色检测各处理组细胞凋亡的形态学改变,流式细胞术检测各组细胞凋亡率的变化。Western blot分析应用Z-VAD-FMK后SGN细胞内Caspase-3的激活抑制情况,免疫细胞化学及激光共聚焦显微镜观察SGN细胞内AIF和Endo G由线粒体向细胞核转位的情况,亚细胞器分离技术及western blot分析AIF和Endo G蛋白在细胞内线粒体和细胞浆的分布改变,real-time PCR检测细胞内AIF和Endo G的mRNA表达,western blot进一步分析SGN细胞Bcl-2和Bax蛋白表达的改变情况。实验结果：吖啶橙染色显示ONOO"可引起新生大鼠耳蜗SGN细胞出现明显的凋亡形态,流式细胞术检测结果表明细胞凋亡率显著上升,Z-VAD-FMK预处理后依然存在ONOO-诱导的大鼠SGN细胞的凋亡,但凋亡细胞数目减少,细胞凋亡率由损伤组的50.27+3.26%降低为实验组的24.25±6.35%(P<0.01)。经western blot证实Z-VAD-FMK可以有效抑制SGN细胞内Caspase-3的激活后,免疫细胞化学显示ONOO--Z-VAD-FMK联合作用可以引起SGN细胞内AIF和Endo G由线粒体向细胞核转位,分离亚细胞器后检测AIF和Endo G蛋白显示,较正常对照组相比,无论施加抑制剂Z-VAD-FMK处理与否,ONOO-均引起SGN细胞内AIF和EndoG在线粒体内含量的降低,细胞浆内含量的升高,及细胞内Bcl-2和Bax的蛋白表达改变。Real-time PCI检测示AIF和Endo G的mRNA表达水平在不同组间未有变化。研究结论：在Caspase蛋白家族活性被抑制后,ONOO-依然可引起体外原代培养的大鼠耳蜗SGN细胞发生凋亡,但程度减轻,证明Caspase-非依赖性凋亡途径在ONOO-损伤SGN细胞的过程中亦发挥部分作用。ONOO-可以诱导大鼠SGN细胞内AIF和Endo G自线粒体释放并进一步转移至细胞核内,且该过程不受Caspase活性的影响,表明AIF和Endo G参与了氮自由基导致的耳蜗SGN细胞的Caspase-非依赖性凋亡。ONOO-调节的SGN细胞内Bcl-2和Bax的蛋白表达改变与Z-VAD-FMK的预处理无关,表明由ONOO-诱导的SGN细胞线粒体内Bcl-2和Bax的激活不受Caspase活性的影响。