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研究背景:免疫逃逸是肿瘤细胞的特征性标志之一,免疫检查点阻滞已成为一种潜在的抗肿瘤免疫治疗方法,应用前景十分广阔。肿瘤细胞表面的“不要吃我”信号CD47可与巨噬细胞表面SIRPα结合,防止巨噬细胞对肿瘤细胞进行吞噬。因此,抑制CD47可能为肿瘤免疫治疗提供一种新策略。microRNAs(miRNAs)是免疫系统中重要的基因表达调控因子。然而,miRNAs在肿瘤免疫中的作用尚不完全清楚。在胰腺癌(pancreatic adenocarcinoma,PAAD)中,miR-340的表达与CD47呈显著负相关。然而,目前对于miR-340的研究非常有限,尤其是在肿瘤免疫中,miR-340的作用尚无报道。研究目的:本研究一方面通过体外实验,研究miR-340在胰腺癌抗肿瘤免疫中的潜在调控机制;另一方面通过体内实验进一步验证体外实验结果,研究miR-340是否可以调节胰腺癌的生长以及肿瘤免疫微环境,通过调控特定免疫细胞的功能,最终抑制胰腺癌的进展。研究方法:我们通过使用Oncomine数据库分析胰腺癌组织与正常胰腺组织中CD47的表达,并通过流式细胞术评估了人胰腺癌细胞系PANC1、BxPC3细胞系以及小鼠胰腺癌细胞系Panc02、H7细胞系表面CD47的表达。采用LinkedOmics数据库以及TCGA数据库分析PAAD患者肿瘤组织中CD47的表达与生存的相关性。通过miRanda、DIANA-microT以及TargetScan进行预测,找到可能靶向CD47的miRNAs,我们进一步通过生物信息学分析,筛选出在多种肿瘤中与CD47表达呈显著负相关的miR-340,并评估了miR-340与PAAD预后的相关性,以及与放疗反应的关系。通过生物信息学、荧光素酶报告基因实验、qRT-PCR以及western blot分析miR-340对CD47表达的调控作用。接下来,我们通过CCK-8、划痕实验及流式细胞术检测miR-340对小鼠胰腺癌细胞系Panc02细胞以及人胰腺癌细胞系PANC1细胞增殖、迁移及凋亡的影响。另外,我们采用miR-NC对照或miR-340稳定高表达Panc02细胞系分别与小鼠腹腔来源巨噬细胞或骨髓来源巨噬细胞共培养,并通过流式细胞术及免疫荧光的方法分析miR-340对巨噬细胞吞噬肿瘤细胞作用的影响。在体内研究中,我们利用小鼠miR-NC对照或miR-340稳定高表达Panc02细胞系,对野生型C57BL/6小鼠进行胰腺癌皮下肿瘤模型及原位肿瘤模型构建。对于皮下移植瘤模型,我们隔天对荷瘤小鼠进行观察并测量肿瘤大小,比较两组小鼠肿瘤体积及重量的差异;对于胰腺癌原位肿瘤模型,检测两组荷瘤小鼠肿瘤组织中miR-340及CD47表达变化,并采用流式细胞术分析荷瘤小鼠外周血、外周免疫器官脾脏以及肿瘤免疫微环境中的关键免疫细胞比例变化。最后,通过使用氯磷酸盐脂质体清除小鼠体内巨噬细胞,研究巨噬细胞在miR-340抑制PAAD发展中的作用。研究结果:我们发现CD47在胰腺癌组织中的表达显著高于正常胰腺组织,CD47在人和小鼠胰腺癌细胞表面均高表达。miR-340通过结合CD47的3’UTR调控并直接抑制CD47表达,miR-340与CD47的表达呈显著负相关,并可提示PAAD患者的生存预后,其表达在接受放疗后显著升高。体外功能研究进一步发现,在Panc02细胞及PANC1细胞中高表达miR-340对细胞增殖、迁移、凋亡均无显著影响,但miR-340在胰腺癌细胞系中表达的恢复足以下调CD47的表达,促进巨噬细胞对肿瘤细胞进行吞噬;体内研究发现,胰腺癌细胞系Panc02中高表达miR-340的皮下及原位肿瘤生长明显受到抑制。miR-340高表达Panc02细胞系胰腺原位荷瘤小鼠肿瘤组织中miR-340表达升高,CD47表达相应降低;在外周血,外周免疫器官脾脏,尤其是肿瘤免疫微环境中,显著促进了在肿瘤杀伤中发挥关键作用的细胞毒性CD8~+T淋巴细胞的增加;此外,miR-340高表达Panc02细胞系胰腺原位荷瘤小鼠脾脏以及肿瘤组织中M1型巨噬细胞比例显著增加,M1型巨噬细胞与M2型巨噬细胞比例的比值也显著增加,表现出向M1型巨噬细胞的极化增强。此外,清除小鼠体内的巨噬细胞可逆转miR-340对肿瘤生长的抑制作用,从而促进胰腺癌的生长,证实巨噬细胞在miR-340的抗肿瘤免疫反应中发挥着重要作用。研究结论:肿瘤细胞中miR-340通过影响肿瘤免疫微环境来抑制小鼠胰腺癌的进展。其具体的调控机制是:迫使肿瘤细胞高表达miR-340可抑制CD47表达,进一步通过影响CD47-SIRPα轴促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用,促进巨噬细胞向M1型极化,促使肿瘤杀伤CD8~+T细胞的增多,最终激活抗肿瘤免疫反应。因此,miR-340是使巨噬细胞发挥吞噬作用和抗肿瘤免疫的关键调控因子,可能作为一个有效的临床治疗胰腺癌乃至其他实体瘤的潜在靶点,在免疫治疗方面具有十分可观的应用前景。