拮抗水稻白叶枯病菌链霉菌的筛选、鉴定和防效研究

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水稻白叶枯病是全世界最严重的水稻病害之一,是由稻生黄单胞菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Ishiyama)Swings,Xoo)引起的,是细菌植物病原体,会影响水稻的产量和品质。在疫情不严重的地区,稻米产量将减少约20-30%,但在某些严重地区,粮食产量将减少80-100%。当前,仅有少数水稻品种对该病具有抗性,而且品种也不能抵抗多种病害。因此研究生物防治是十分必要的。放线菌用于植物病害的生物防治有很长的历史,并且已经被广泛研究。它们分解植物残体聚合物为简单化合物,对生态系统很重要,放线菌大多数是以孢子形态存在于土壤中。在次生代谢产物中的许多是抗生素,产生用于于固定相。本研究对具有拮抗水稻白叶枯病菌的链霉菌进行鉴定和防效研究。1.从不同地方取的土壤样,比如,从浙江师范大学校园里的草地、树根的周围、垃圾区与食堂区的土壤,获得了65放线菌菌株。将各放线菌菌株与白叶枯病菌进行共培养,初筛获得8株有拮抗作用的放线菌菌株。利用牛津杯法进行复筛。经过复筛,抑菌圈最大的是放线菌Sr-63菌株,抑菌圈平均为46.48±2.32 mm。在系统发育树发现该放线菌Sr-63菌株没有和任何放线菌菌株是同一进化分类,但可以确定该放线菌属于链霉菌属,并且与玫瑰轮丝链霉菌(Streptomyces roseoverticillatus)最接近。该菌能利用蛋白胨、胰蛋白胨、L-谷氨酸、L-天门冬酰胺、硝酸钾(KNO3)、L-异亮氨酸为氮源;能利用葡萄糖、蔗糖、棉子糖、鼠李糖、α-乳糖、甘露糖、半乳糖、木糖、肌醇与阿拉伯糖为碳源;最合适的Na Cl浓度是1%,可以生长高于2%Na Cl的条件;最合适的酸碱环境是p H 6-7,能生长的酸碱环境是p H 3-11;最合适的培养温度是28-37℃,能生长的培养温度范围是20-43℃。2.链霉菌Sr-63菌株在不同培养基拮抗水稻白叶枯病菌的效果。高氏一号培养基:培养5 d抑菌圈最大,抑菌圈直径平均为46.50±1.05 mm。改良PD培养基:培养6 d抑菌圈最大,平均为45.50±0.58 mm。PD培养基:培养9 d抑菌圈最大,平均为41.75±0.96 mm。Hiskey培养基:培养5 d抑菌圈最大,平均为46.00±0.82 mm。GYM培养基:培养7 d抑菌圈最大,平均为27.75±0.50 mm。ISP2培养基:培养9 d抑菌圈最大,平均为34.00±0.82 mm。SCA培养基:培养9 d抑菌圈最大,平均为32.75±0.96 mm。从上面的结果可知,Sr-63菌株拮抗水稻白叶枯病菌的效果最优是高氏一号培养基。3.链霉菌Sr-63菌株发酵条件优化实验,将高氏一号培养基的成分进行优化。碳源优化筛选结果为可溶性淀粉,抑菌圈直径平均为36.00±1.26 mm,而在浓度5%时,抑菌圈直径平均为54.33±1.75 mm。氮源优化筛选结果为KNO3,抑菌圈直径平均为37.17±0.98 mm,而在浓度0.3%时,抑菌圈直径平均为46.33±2.07 mm。Na Cl浓度为0.5%,抑菌圈直径平均为44.33±0.82 mm。酸碱优化筛选结果为p H 7,抑菌圈直径平均为43.17±1.17 mm。培养时间优化筛选为结果5 d培养,抑菌圈平均为46.50±1.05 mm。培养温度优化筛选结果为:28℃抑制作用最好,抑菌圈直径平均为46.33±1.21 mm。培养转速优化筛选结果为:160 rpm抑制作用最好,抑菌圈直径平均为43.50±1.64 mm。在上述培养基改良和发酵条件下,链霉菌Sr-63菌株产抑菌活性物质能力显著提高,其抑菌圈直径达48.83 mm±1.17 mm。4.链霉菌Sr-63菌株发酵滤液的抗菌谱和稳定性实验,除了能拮抗水稻白叶枯病菌外,还能够拮抗其他植物病原细菌与植物病原真菌,效果最好的植物病原细菌是水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola),抑菌圈最大为25.33±0.76 mm;最有效的植物病原真菌是杨树枯萎病菌(Fusarium solani),抑菌率平均为12.62%。发酵滤液稳定性试验。光照稳定性:紫外光对其有很大的影响,照射时间达到18 h之后,抑制效果降低了57.35%,但是普通日光灯无显著的影响。温度稳定性:高温也对其有很大的影响,温度达到90-100℃时,抑制效果降低了59.39%。5.水稻防效实验,采用对水稻白叶枯病P6生理小种感病的6个水稻品种,其中5种是泰国的水稻种子(泰国黑糯米、Chai Nat 2、Khaoluang、KDML 105、糯米RD)和1种中国的水稻种子(中花11),以此对比。方法1(先喷洒发酵滤液,再接种病菌)对泰国与中国水稻病斑的抑制效果最好,尤其是中花11、KDML105、Khaoluang和Chai Nat 2,病斑抑制率都高达90%以上,病斑抑制率分别为95.35%、94.39%、94.14%和92.86%。其次是方法5(种水稻以前,先浇发酵滤液到土壤上预防,再接种病菌)抑制作用效果较好,尤其是KDML105和Khaoluang,病斑抑制率分别为80.14%和75.83%。跟着方法1将链霉菌Sr-63菌株的发酵滤液与化学农药叶枯唑对比防效能力,除了泰国黑糯米以外,防治效果均比叶枯唑化农药好。从结果可知,链霉菌Sr-63菌株的发酵滤液预防水稻白叶枯病菌的效果显著。
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