酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae A20降解链格孢酚的初步研究

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链格孢酚(Alternariol,AOH)是一种主要由链格孢菌属产生的有毒次级代谢产物,研究证实AOH具有较强的基因毒性、诱变性、致癌性、细胞毒性等,能够造成细胞周期停滞和细胞凋亡,影响细胞正常增殖,抑制拓扑异构酶I和II的活性。AOH在农产品及其制品中的污染范围十分广泛而且往往与其它链格孢毒素发生协同增强作用,两者叠加使毒性显著增强。AOH作为一种危害性较高的真菌毒素,已经严重影响了人类和动物的健康。现今迫切需要寻找一种生物降解AOH的方法,降低其危害及人类接触的风险性,从而提高食品和饲料的安全性。论文筛选出了1株高效降解AOH的酿酒酵母菌,研究了该酵母菌降解AOH的效率及其可能的降解机制,并对共培养产物P1的结构和性质分析,主要研究成果和结论如下:(1)本研究通过对贮藏过程中的葡萄果实表皮及其内容物、果园土壤、泡菜中的微生物富集培养,以粗提的AOH为唯一碳源进行分离筛选。结果:筛选到1株高效降解AOH的菌株,命名为A20,初步验证降解效率达到50%以上。通过形态学观察、生理生化特征,并结合26S r DNA基因序列分析,初步鉴定菌株A20为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。此外,通过纸片扩散法验证得知菌株A20对链格孢菌生长没有拮抗性。同时采用PI荧光染色,探究在外源添加5μg/m L AOH与菌株A20共培养时,AOH对菌株A20生长的影响。PI荧光染色实验结果证实,菌株A20在添加AOH造成胁迫的逆境下培养4 d后,菌体细胞膜受到破坏,通透性失调。(2)探究不同培养基、p H值、AOH初始浓度、菌株接种量等因素对S.cerevisiae A20降解AOH效率的影响,结果表明,S.cerevisiae A20在28℃,接种量按照2%,控制AOH的初始质量浓度为4μg/m L,p H 6的YEPD培养基中培养4 d后,降解率最高达到65.89%。(3)初步探究A20菌株去除AOH的作用机理,通过使用超声仪,并利用反复萃取实验表明A20菌株对AOH的去除过程主要是降解作用,且新产生了单一的稳定物质P1。此外,通过AOH的降解动力学表明,在4 d内YEPD中菌株A20可迅速降解AOH,而从4 d后对AOH的降解率几乎稳定。(4)初步明确S.cerevisiae A20降解AOH的催化特性,对S.cerevisiae A20的胞外提取液、菌悬液和胞内提取液降解AOH的活性物质进行定位与定性。结果显示,S.cerevisiae A20胞外提取液对AOH有较好的降解效果,降解效率为58.47%,S.cerevisiae A20菌悬液对AOH几乎没有降解作用,降解率为3.33%;YEPD培养基正常培养的S.cerevisiae A20胞内提取液对AOH降解效果不佳,降解率仅为13.35%;初步推断S.cerevisiae A20对AOH的去除主要是降解作用而非吸附。经热处理和蛋白酶K处理胞外提取液后,催化AOH降解的效果显著降低。因此,推测S.cerevisiae A20分泌的胞外蛋白酶可能降解了AOH而降低其浓度。(5)分离制备S.cerevisiae A20与AOH共培养产生的单一组分P1并加以分析。经有机溶剂分级萃取、硅胶柱层析和高效制备液相等方法分离纯化,利用液相质谱联用仪、核磁共振谱图数据进行结构分析,得出产物P1分子量为161,分子式C10H11NO,淡棕色晶体,综合鉴定为色醇。此外,还进一步探究了在最优降解条件下,AOH对菌株A20生长的影响,PI荧光染色实验结果证实,菌株A20在添加AOH造成胁迫的逆境下培养4 d后,菌体细胞膜受到破坏。
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