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目的：
探讨miRNA表达载体靶向沉默Rab5a基因或蛋白表达对人乳腺癌细胞MCF-7体外增殖与侵袭能力的影响,为乳腺癌的基因靶向治疗提供新的实验依据和理论基础。
方法：
1.根据Rab5a基因序列(Genbank:NM-004162)应用Invitrogen公司RNAi设计软件设计并合成4对miRNA oligo和一对阴性对照oligo进行重组克隆,将双链的miRNA oligo分别插入到miRNA表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR中,构建4组miRNA表达质粒及一组阴性对照质粒。
2.将4个重组质粒和1个阴性对照质粒分别转染至6孔板的MCF-7细胞,48h后确定其转染效率。
3.收集转染48h后6孔板中各组细胞,提取总RNA。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定MCF-7中Rab5a的mRNA的表达,筛选出一组基因水平抑制效率最高的miRNA干扰载体。
4.收集转染48h后6孔板中各组细胞,提取细胞蛋白,测定蛋白浓度后,Western Blot测定MCF-7中Rab5a蛋白的表达。筛选出一组蛋白水平抑制效率最高的miRNA干扰载体。
5.选择干扰效率最高一组干扰质粒转染至MCF-7细胞,并设空白对照及阴性对照组,48h后收集各组细胞接种于4块96孔培养板中继续培养,MTT法测定细胞于继续培养12、36、60、84h时的增殖活性,绘制细胞增殖曲线,并计算细胞的增殖抑制率:增殖抑制率(％)=(1-A实验组/A空白组)×100％
6.选择干扰效率最高一组干扰质粒转染至MCF-7细胞,并设空白对照及阴性对照组,48h后收集各组细胞,并利用Transwell小室计数侵袭过膜的细胞数,测定对细胞的侵袭能力的影响。
结果：
1.转染Rab5a-miRNA-2干扰载体对MCF-7细胞Rab5a表达抑制效果较其它3组最明显,RT-PCR结果显示其对Rab5a基因mRNA抑制率达(50.01±2.69)％,Western Blot结果显示其对Rab5a蛋白抑制率达到(55.58±3.16)％。因此,选择Rab5a-miRNA-2组干扰载体进行后续实验。
2.MTT实验显示,Rab5a-miRNA-2干扰Rab5a对细胞增殖的抑制率在12h、36h、60h、84h分别为(2.47±0.08)％、(19.69±2.03)％、(24.81±0.96)％、(32.90±2.48)％,与空白和阴性对照组间差异均有统计学意义(P＜0.01)。
3.Transwell实验显示,Rab5a-miRNA-2组穿膜细胞数为(67.8±12.03),与阴性对照组和空白对照组之间均有显著性差异(P＜0.01)。
结论：
miRNA表达载体靶向沉默Rab5a基因可以抑制乳腺癌细胞MCF-7的体外增殖和侵袭能力。