论文部分内容阅读
氧化亚氮(N2O)是第三大温室气体，全球范围内其汇和源的估算长期不均衡，汇大于源。植物源N2O已被多项研究报道，但由于植物N2O合成机理不甚明确，植物源N2O尚未被列入排放估算清单。目前对植物排放N2O的争议在于，植物细胞并不具备完整的N2O合成通路。生物合成的N2O主要源自被还原的一氧化氮(NO)，但是植物细胞内缺少NO还原酶及相关编码基因。这使得植物的N2O排放能力一直没有被学术界确定。本文在前人研究的基础上，提出了植物通过与内生菌互作，协同完成N2O生物合成及排放的假说。基于上述假设，本研究通过外植体诱导技术和无菌实生苗培养技术构建了差异内生菌的苗期大豆模型。采用气相色谱、同位素比例质谱、高通量测序、荧光定量PCR等检测方法，对上述模型的N2O排放通量、N2O-15N特征、内生菌多样性、细菌源NO还原酶（cnorB）的表达强度等指标进行检测和关联性分析。获得的主要结果如下: 外植体诱导苗完全不含内生菌，无菌实生苗的内生菌体系完全由种子内生菌定殖和扩繁而来。土培苗全株的内生菌丰度(1.23×108±4.22×107Copies of recA gene g-1fw tissue)与原位土壤总细菌丰度(1.18×107±1.58×107Copies of recA gene g-1fw tissue)类似，无菌实生大豆的内生菌丰度(6.09×107±1.05×107Copies of recA gene g-1fw tissue)约为土培大豆的一半。土培苗和无菌实生苗的内生菌种群存在巨大差异。无菌实生苗呈现了极低的内生菌多样性和属水平生态位混乱，绝大多数定殖物种丰度极低，无菌实生苗的微生物构成与大田作物差异显著。大豆种子内定殖的内生菌种类远超我们预计，其覆盖了绝大部分植物内生菌物种。隔绝土壤培养的大豆无法将种传内生菌扩繁为合理的内生菌体系。种传内生菌在无菌培养条件下，倾向于定殖在好氧度较高的植物器官。供试大豆的核心固氮菌构造为:Bradyrhizobium-Methylobacterium型。 N2O通量观测结果显示，无菌大豆不排放N2O。苗期大豆的全株N2O排放通量为111.7±25ng N2O g-1fw h-1，是原位土壤(6.91±2ng N2O g-1fw h-1)和无菌实生苗（8.16±2ng N2O g-1fw h-1）的五倍之多。大豆在有光照和无光照背景下呈现迥异的N2O排放特征，日间大豆的N2O排放通量及其N2O-δ15N值(132.40±19.93ng N2O g-1fw h-1，29.67.71±3.45‰)显著高于夜间(11.04±1.98ng N2O g-1fw h-1，5.62±1.07‰)。这说明，植物N2O的合成通路与光合作用紧密偶联。N2O的同位素特征显示，植物在日间更倾向于通过反硝化作用，将原子序数较大的氮素排出体外。本研究观测到Bradyrhizobium，Arthrobacter，Microbacterium和Noviherbaspirillum为“铁丰31”大豆主要的反硝化种群。植物N2O的排放通量与内生反硝化细菌的数量(r2=0.9546，p=0.002)及其NO还原酶(cnorB)的表达丰度(r2=0.8846，p=0.002)显著相关。这说明，植物体内的反硝化微生物及其NO还原过程是植物N2O排放的限速步骤。 本研究认为，植物源氧化亚氮对农业生态系统氧化亚氮排放总量贡献巨大。但是植物细胞本身可能不具备合成N2O的能力。植物源N2O的排放由植物和微生物合作完成。植物细胞仅能通过亚硝酸盐还原和精氨酸异化提供合成N2O所需的底物NO，但不能完成NO到N2O的转化。这一步反应由内生反硝化细菌携带的cnorB催化完成。