草鱼(Ctenopharyngodon idellus)属于低等脊椎动物,是我国重要的经济淡水鱼类之一,对于其免疫系统工作机理的认识有助于科学地指导生产实践并拓宽对于免疫系统进化方式的认识。由于处于复杂的水生环境中,鱼类的先天性免疫系统在抵御病毒、细菌、原生动物等的入侵中发挥非常重要的作用。巨噬细胞是先天性免疫系统中的重要成员,由于具有自增殖特性和在不同微环境中的极化特性,因而具有作用持久和方式多样化的特性,在先天性免疫系统中处于核心地位。头肾扮演着类似于哺乳动物骨髓的角色,是鱼类髓系细胞的生发地。本文针对草鱼头肾单核/巨噬细胞的分离、鉴定和激活等方面,开展了相关因子的克隆鉴定和重组表达工作,探索了头肾单核/巨噬细胞以及淋巴细胞的分离方法,并多方面鉴定所分离的细胞,最后阐明了一个激活的淋巴细胞参与的单核/巨噬细胞的激活新机制。研究结果主要包括以下方面:　　1.克隆获得两个能促进巨噬细胞增殖和分化的草鱼巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)的cDNA序列,分别命名为gcM-CSF1和gcM-CSF2。经进化分析表明,这两条序列分别与已知的斑马鱼和虹鳟的M-CSF1和M-CSF2聚为一类,而M-CSF2与哺乳动物的M-CSF的进化关系相对较远。同源分析表明,虽然序列的一级序列相似度较低,但gcM-CSF1和gcM-CSF2都含有较为相似的结构特征,包括信号肽、保守的CSF-1结构域、跨膜区和胞内区,且gcM-CSF1还具有一段位于CSF-1结构域之后的较长的胞外区序列。同时,分离鉴定了草鱼M-CSF受体(M-CSFR),从进化和同源分析以及组织分布性上确认所获得的序列为目的序列,为之后作为分子标记鉴定单核/巨噬细胞打下了基础。　　2.探索了鱼类M-CSF重组表达的新方法。以往的研究中均采用动物细胞重组表达M-CSF,或者难以获得纯的M-CSF蛋白,或者得率较低而不适合大量制备。本研究尝试了原核表达系统之后,最终优化酵母表达系统的培养方案,并高效地获得了糖基化的草鱼M-CSF重组蛋白,尤其是获得了M-CSF2的重组蛋白,这项工作在鱼类的研究中尚未见报道。用酵母表达获得的两种M-CSF重组蛋白可用于甄别鱼类的两个M-CSF的功能和诱导巨噬细胞系的产生。　　3.借助双层不连续密度梯度离心分离的方法,富集了草鱼单核/巨噬细胞和淋巴细胞,然后多方面对细胞作出鉴定:　　⑴借助细胞染色从形态上鉴定,发现超过90％的细胞大小在10-12 mm,含偏离中心的细胞核,核质比较小,符合金鱼单核/巨噬细胞的特征;而来自于两层分离液中间的细胞群中80％的细胞为约6-8 mm的小圆形细胞并含有相对较大的细胞核。　　⑵分子标记检测结果显示,在新鲜分离的头肾细胞( HKC)中能检测到单核/巨噬细胞(M-CSFR)、T细胞(TCRb)、B细胞(IgM)以及中性粒细胞(MPX/MPO)的标记分子的表达。M-CSFR的表达几乎限于获取的上层细胞,而TCRb和IgM的表达则主要存在于获取的下层细胞。此外,MPX/MPO的表达在两层细胞中都较低,说明在分离的细胞中的中性粒细胞的污染较少。根据以上形态特点和标记基因表达谱分析可知,获取的上层和下层细胞分别被命名为单核/巨噬细胞和淋巴细胞。　　⑶重组草鱼IFN-g(rgcIFN-g)单独或联合LPS作用72 h,可刺激单核/巨噬细胞释放NO水平升高,但淋巴细胞对此无反应,这与哺乳动物中单核/巨噬细胞与淋巴细胞对IFN-g的反应动力学一致。　　⑷草鱼单核/巨噬细胞也具有高细胞密度下的自增殖能力,低密度细胞培养可在重组草鱼M-CSF(rgcM-CSF)的作用下获得增殖能力。以上证据说明利用密度梯度离心的方法分离获得了草鱼头肾单核/巨噬细胞与淋巴细胞。　　4.利用分离的草鱼单核/巨噬细胞和淋巴细胞,探索了一种新的单核/巨噬细胞被激活的方式。本论文研究表明,虽然淋巴细胞不具有在rgcIFN-g的单独或联合 LPS的刺激下释放一氧化氮(NO)的能力,但是,rgcIFN-g激活的淋巴细胞,可以通过分泌细胞因子的作用增强rgcIFN-g刺激的单核/巨噬细胞释放NO的能力。具体地,rgcIFN-g刺激淋巴细胞分泌的促炎症因子IL-1b即可协同IFN-g强烈地诱导单核/巨噬细胞释放NO,并可缩短诱导时间(从72 h提前至48 h)。这一研究结果丰富了对IFN-g激活单核/巨噬细胞激活机制的认识,即IFN-g可以通过激活其它免疫细胞(淋巴细胞)来调节单核/巨噬细胞的激活状态,为鱼类免疫系统中单核/巨噬细胞与淋巴细胞之间的作用关系提供了有力的证据。