论文部分内容阅读
哺乳动物胚胎体外生产效率低,很大程度上与卵母细胞体外成熟质量差以及卵母细胞和早期胚胎暴露于人工化学合成静态的、不适的体外培养环境中造成的氧化应激有关。哺乳动物卵母细胞和胚胎胞质氧化还原稳态的维持是影响卵母细胞体外成熟质量以及胚胎发育潜能的关键因素之一。科学研究表明,哺乳动物卵巢上卵泡内壁层颗粒细胞产生的生理性旁分泌因子C型利钠肽（C-type Natriuretic Peptide,CNP）具有维持卵母细胞减数分裂停滞的特性。此外,近年的研究表明,原癌基因SHC（Src homology 2 domain-containing transforming protein C,SHC）编码的亚型66KDa线粒体氧化应激蛋白（p66Shc）及其信号特性在调控细胞氧化应激、细胞凋亡和机体衰老过程中发挥了重要作用。本研究旨在探讨C型利钠肽预孵育绵羊卵丘卵母细胞复合体对卵母细胞核减数分裂进程及成熟质量的影响,采用C型利钠肽暂时抑制绵羊卵母细胞核减数分裂进程延长胞质成熟时间,促进核质同步成熟,以期提高绵羊卵母细胞体外成熟质量及其受精后胚胎的发育潜能,同时研究了氧化应激蛋白p66Shc在绵羊卵母细胞和胚胎中的表达特征以及对胞质氧化还原稳态调控的分子机理,为改善绵羊体外培养体系,提高体外胚胎生产效率提供理论依据。本研究构建了绵羊卵母细胞体外“双阶段”成熟培养体系,分析了氧化应激基因p66Shc在卵母细胞和早期胚胎中mRNA和蛋白的表达模式,以及与线粒体分布和活性、ROS水平及氧化还原稳态的关系,为进一步研究p66Shc对卵母细胞和早期胚胎氧化还原调控分子机制网络以及p66Shc的功能作用提供理论依据。综上所述,得到如下研究结果:1.利用C型利钠肽构建绵羊卵母细胞体外“双阶段”成熟培养体系。首先使用生理性减数分裂抑制剂C型利钠肽预孵育液孵育绵羊卵丘卵母细胞复合体（Cumulus Oocyte Complexes,COCs）,然后转入成熟液中进行第二阶段的体外成熟（In Vitro Maturation,IVM）。结果表明,200 nM/L CNP能够在4 h之内有效维持绵羊COCs的减数分裂停滞,而且CNP受体NPR2（Natriuretic Peptide Receptor 2,NPR2）主要在绵羊卵丘颗粒细胞上表达。与常规标准24 h IVM和其他实验组相比,200nM/L CNP预孵育COCs 4 h,然后体外成熟24 h的囊胚率和囊胚质量显著优于其他实验组（P<0.05）。此外,成熟前生发泡期（Germinal Vesicle,GV）卵母细胞中线粒体主要呈现明亮的周边分布和整个细胞质中细微的弥散分布模式。而200 nM/L CNP预孵育COCs 4 h后,线粒体颗粒定位到胞质外周和核周区域。200 nM/L CNP预孵育4 h然后体外成熟24 h的卵母细胞线粒体分布与常规24 h成熟卵母细胞的线粒体分布模式相似,线粒体主要集中于卵母细胞的皮质区域,但线粒体簇更多、更大。这些结果表明,CNP预孵育绵羊COCs提高了卵母细胞的成熟质量和发育能力,并且具有促进体外胚胎生产效率的巨大潜力。2.p66Shc在绵羊卵母细胞中的表达特征及其与胞质氧化还原稳态的关系。采用RT-qPCR（Real-Time quantitative PCR,RT-qPCR）对成熟前后不同质量绵羊卵母细胞中p66Shc mRNA的表达丰度进行分析,利用细胞免疫荧光结合MitoTracker Red探针对p66Shc蛋白和线粒体进行共定位,同时利用荧光探针DCFH-DA和卵母细胞自发荧光分别对成熟前后不同质量卵母细胞内ROS水平和氧化还原稳态进行检测,此外,采用外源促氧化剂过氧化氢（Hydrogen Peroxide,H2O2）诱导的氧化应激处理成熟前优质卵母细胞。结果表明,成熟前劣质和成熟后老化卵母细胞中p66Shc mRNA和蛋白的表达分别显著高于成熟前优质和常规24 h成熟的卵母细胞（P<0.05）;与成熟前优质和常规24 h成熟的卵母细胞相比,成熟前劣质和成熟后老化卵母细胞表现出线粒体分布紊乱和活性下降、ROS水平升高以及氧化还原稳态失衡的状态,此外,外源H2O2诱导的氧化应激显著上调p66Shc蛋白的表达（P<0.05）并促使p66Shc由胞质向细胞核定位。综上表明,p66Shc在劣质和老化的绵羊卵母细胞中呈现高水平的表达特征,p66Shc高表达影响了绵羊卵母细胞胞质氧化还原稳态。3.p66Shc在绵羊早期植入前胚胎发育过程中的表达和空间定位模式。采用RT-qPCR技术和细胞免疫荧光技术检测p66Shc基因在早期胚胎发育过程中mRNA表达丰度和蛋白表达水平及空间定位模式。结果表明,p66Shc mRNA和蛋白在早期胚胎发育的各个阶段均有表达,p66Shc mRNA在4-8细胞阶段显著下调（P<0.05）,在胚胎基因组激活后的桑椹胚和囊胚阶段显著上调（P<0.05）。细胞免疫荧光染色结果表明,p66Shc蛋白主要定位于植入前胚胎发育各个阶段卵裂球细胞质的周边区域。值得注意的是,36位丝氨酸（Ser-36）磷酸化的p66Shc在胚胎基因组激活之前2-8细胞阶段仅定位于细胞质,胚胎基因组激活后磷酸化的（Ser-36）p66Shc不仅定位于细胞质区域,而且主要在细胞核定位。由此推测,p66Shc基因的表达与定位与绵羊早期胚胎发育调控存在密切的关系。4.p66Shc参与绵羊早期植入前胚胎发育过程中过氧化氢诱导的细胞质氧化应激。研究结果表明,早期卵裂（≤28 h）胚胎的囊胚率（66.67%）显著高于晚期卵裂（>28 h）胚胎的囊胚率（22.93%）（P<0.05）。与早期卵裂胚胎相比,晚期卵裂胚胎p66Shc mRNA和蛋白高丰度表达并且线粒体活性较低。此外,外源性H2O2诱导的氧化应激显著降低胚胎发育能力（P<0.05）,上调p66Shc蛋白的表达丰度（P<0.05）,然而抗氧化剂（1U/ul过氧化氢酶和10-66 mol/L褪黑素）处理缓解了H2O2诱导胚胎发育能力衰退、ROS积累以及p66Shc表达的累积。外源性H2O2诱导的氧化应激诱导了36位丝氨酸（Ser-36）磷酸化的p66Shc从胞质向细胞核定位。这些结果表明p66Shc及其Ser-36磷酸化参与了绵羊植入前胚胎发育过程中的胞质氧化应激调节。5.siRNA显微注射敲低p66Shc降低了绵羊胚胎氧化损伤的风险并提高了胚胎的发育能力。将靶向p66Shc特异的CH2结构域的3种特异性siRNA分子显微注入绵羊合子阶段的细胞质中,同时设计了3个对照组（没有注射,注射溶剂无酶水和注射非特异性siRNA）以测试显微注射技术的潜在作用及干扰分子的特异性。结果表明,在绵羊合子阶段显微注射p66Shc siRNA导致p66Shc的mRNA和蛋白质水平显著降低（P<0.05）。p66Shc敲低胚胎表现出细胞内ROS水平显著降低（P<0.05）和DNA氧化损伤标志物8-OHdG的显著减少（P<0.05）,并且p66Shc敲低胚胎表现出发育至桑葚胚的倾向。这些发现表明,敲低p66Shc可能提高了胚胎在基因组激活阶段对氧化应激的抵抗力。