胃癌是世界范围内癌症相关性死亡的第二原因,尽管有先进的诊断工具和治疗方法,由于肿瘤复发、转移和耐药,胃癌患者的五年的生存率仍不到30%。因此胃癌复发、转移和耐药仍是限制其疗效的主要因素。寻找高度特异性治疗靶标是提高胃癌疗效乃至根治的重要途径,为研究胃癌的发生和发展机制开辟了新途径。近年来兴起肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs)理论为该途径提供了新的思路。胃癌干细胞(gastric cancer stem cells, GCSCs)是胃癌发生、发展、浸润、转移及复发的重要因素,对其进行研究,寻找和鉴定特异性的GCSCs的分子标志物,并且明确其相关分子的调控机制。在本研究中,我们使用流式细胞荧光分选和无血清成球培养的方法,从胃癌细胞系中分离/富集了胃癌干细胞亚群CD44和CD90,实时定量PCR检测发现胃癌细胞系SNU-5和SNU-16中CD44和CD90阳性细胞高表达干性相关基因Sox 2、Oct-4和Nanog;无血清成球培养实验表明SNU-5和SNU-16中CD44和CD90的阳性细胞的成球能力明显强于其阴性细胞；移植瘤实验也表明同数量级的SNU-5和SNU-16中CD44和CD90的阳性细胞较其阴性细胞具有更强的肿瘤形成能力,上述结果从干性基因表达、自我更新能力和致瘤性等几个主要方面证实了胃癌细胞系SNU-5和SNU-16中CD44和CD90阳性细胞具有CSCs的特性。体外Transwell小室侵袭实验发现SNU-5和SNU-16的GCSCs亚群CD44的阳性细胞较其CD90的阳性细胞具有更强的侵袭能力；而CCK8增殖实验检测表明SNU-5和SNU-16的GCSCs亚群CD90的阳性细胞较其CD44阳性细胞具有更强的增殖能力,同时CD44和CD90阳性细胞的体内移植瘤实验中,我们发现CD44阳性细胞形成的移植瘤浸润周围组织并有肺转移,而CD90阳性细胞形成的移植瘤具有完整的包膜。我们进一步发现CD44阳性细胞呈EMT表型并具有高侵袭转移潜能,CD90阳性细胞呈细胞周期表型具有高致瘤性的特性。通过基因芯片分析,我们筛选出在GCSCs亚群CD44和CD90阳性细胞中一系列差异表达的基因,发现ENO1在GCSCs亚群CD44阳性细胞中表达增高尤为突出,因此进一步研究了ENO1在调控GCSCs亚群CD44阳性细胞中自我更新及侵袭转移中的作用及其可能的分子机制,并探讨了其在胃癌标本中表达的临床意义。通过Western Blot检测筛选出高表达ENO1的SNU-5和低表达ENO1的BGC-823的细胞模型,同时流式细胞荧光分析发现ENO1在SNU-5的细胞膜富集表达,且SNU-5中ENO1与CD44阳性细胞具有共定位现象。利用慢病毒干扰SNU-5中CD44阳性细胞ENO1的表达后,可以显著抑制SNU-5中CD44的阳性细胞的成球能力、成瘤能力和侵袭转移能力；发现过表达ENO1后增强BGC-823中CD44阳性细胞的成球能力、成瘤能力和侵袭转移能力。另外,本室制备靶向ENO1的功能性单抗21A3对SNU-5中CD44阳性细胞体外功能的影响实验表明,单抗21A3可以显著抑制SNU-5中CD44的阳性细胞的成球和侵袭能力。对SNU-5中CD44阳性细胞和阴性细胞进行基因芯片及信号通路分析,发现PI3K/Akt信号通路改变最大。Western blot检测在稳定干扰ENO1的SNU-5中CD44阳性细胞的EMT标志物Vimentin表达降低及细胞周期蛋白Cyclin D1c-myc的下调表达,以此同时E-cadherin和p21的上调表达,伴随PI3K/Akt信号通路Akt和P13K的磷酸化水平降低,膜ENO1和膜uPA蛋白也伴随下调,而过表达ENO1的BGC-823中CD44阳性细胞Akt和P13K的磷酸化水平上升,同时膜ENO1和膜uPA蛋白也表达上升,提示ENO1的作用可能通过Akt信号通路激活。对95例胃癌标本免疫组化染色检测结果显示,与ENO1的表达成正相关,而与患者的生存时间成负相关,ENO1可以作为判断胃癌预后的重要指标。本文的主要结论如下：流式荧光分选和无血清成球培养是一种能够成功分离/富集GCSCs的有效方法；所获得的GCSCs亚群CD44和CD90阳性细胞具有自我更新、高成瘤、高侵袭转移特性；其特性可能依赖于PI3K/Akt、Wnt信号通路、TGF-β信号通路和抗凋亡信号通路的活化；ENO1在GCSCs亚群CD44细胞维持干性和侵袭转移调控中发挥重要作用,其调控作用的发挥可能主要依赖PI3K/Akt信号通路的激活。ENO1的表达与临床病理参数成正相关,与患者生存时间成负相关,可以用作判断胃癌预后的指标。