【目的】胸膜肺炎放线杆菌(App)是猪传染性胸膜肺炎的病原菌,该病是一种以肺脏的出血、坏死以及纤维素性胸膜粘连为特征的传染病。虽然App 的毒力因子是多冈素的,其溶血外毒素(Apx)被认为是该菌最主要的毒力因子及保护性抗原,其N-端具有保护性抗原表位。本研究旨在应用分子生物学技术,对编码ApxI 和ApxIII N-端的apxIA 和apxIIIA 部分基冈片段在原核表达系统中进行表达,为建立猪传染性胸膜肺炎的新型诊断方法和高效亚单位疫苗的研制奠定了基础。【方法】本研究以提取的App 基因组DNA 为模板,用PCR 法扩增出apxIA 和apxIIIA 全基因(3069bp 和3159bp),扩增产物插入到pMDl8-T 载体中,转化人肠杆菌JMl09 后得到重组质粒pMD-apxIA 和pMD-apxIIIA,并经酶切、PCR 和测序鉴定。再以重组质粒为模板,用特异性表达引物扩增得到目的基因:即编码ApxI 和ApxlII 的N-端的apxI A 和apxIII A 基因的片段(1 149bp 和1194bp)。对目的基因和表达载体分别以相同的限制性内切酶酶切后,经连接转化E.coli DH5a 宿主菌构建成重组融合表达载体pET-apxIA 和pET-apxIlIA。将它们转化入E.coli JMl09(DE3),用IPTG 诱导各重组菌进行表达。裂解细菌后,对不溶性包涵体先用低浓度尿素纯化和洗涤,再经高浓度尿素溶解处理得到初步纯化的蛋白质。【结果】重组质粒pMD-apxIA 和pMD-apxIIIA 经鉴定证明克隆成功,所测apxIA 全基因的核苷酸序列与Genbank 数据库中公布的同源参考序列(编号AF363361、D16582)的同源性为93%~99.2%;apxIIIA 全基因的核苷酸序列与GenBank 上血清2 型(EWSDSLl2145)的同源性为95%,与血清8 型(X68815)的同源性达90.8%。编码ApxI 和ApxIII 的N-端的apxIA和apxllIA 基因片段(1149bp 和1194bp)成功插入表达载体pET-28a(+),构建了重组表达载体pET-apxlA 和pET-apxIlIA。SDS-PAGE 电泳、Western-blotting 分析结果表明apxIA 和apxIIIA 基因在人肠杆菌中能高效表达,表达量占菌体蛋白总量的30%以上,表达的两种目的蛋白的分子量人约均为4l ku。表达产物为融合蛋白,能被Apx 免疫猪的刚性血清所识别。表达产物以不溶性包涵体形式存在,此包涵体蛋白不易降解,经处理得到初步纯化的蛋白质。