新疆维吾尔族高危HPV感染宫颈鳞癌组织中miRNA的初步研究

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目的:1)探讨高危人乳头瘤病毒(HR-HPV)在新疆维吾尔族宫颈鳞癌患者中的感染状态,分析其表达状态与宫颈鳞癌的相关性。2)研究miRNA在新疆维吾尔族正常宫颈(normal cervical epithelium,NCE)与高危HPV感染的侵袭性宫颈癌(invasivecarcinoma of cervix,ICC)中的表达水平差异,及其在侵袭性宫颈癌中与各临床指标间的相关性。3)在体外细胞实验中研究验证miRNA在HPV阳性宫颈鳞癌细胞中的生物学功能。方法:1)选择第二代杂交捕获(Hybrid capture,HC2)检测HR-HPV阳性的30例维吾尔族宫颈鳞癌患者,利用巢式PCR检测其组织标本中的HPV16-DNA的表达,多重Taqman探针荧光定量PCR检测HPV16-DNA在组织中的存在状态。2)应用miRNA基因芯片(Agilent Human miRNA8*60K)检测新疆维吾尔族正常宫颈及HPV阳性的宫颈鳞癌组织样本各6个,利用T检验的p值和倍数变化值进行差异miRNA筛选,筛选的标准为上调或者下调倍数变化值≧2.0且P值≦0.05,对差异miRNA进行聚类分析。3)根据基因芯片结果,筛选出19个差异表达的miRNA、5个差异表达的靶基因,进而采用RT-PCR的方法检测其在20例NCE和20例ICC组织样本中miRNA的表达状况,并结合临床病理资料进行统计学分析;4)在siHa细胞中筛选表达丰度下调的miRNA,挑选出丰度下调的15个miRNA,经慢病毒包被后经高通量筛选(HTS),筛选出有功能的miRNA,进一步推测其在发病机制中的作用及功能做准备。结果:1)宫颈鳞癌(SCC)患者HPV-16阳性率为96.7%,与HC2检出率差异无统计学意义(p﹥0.05); HPV-16DNA在宫颈鳞癌组织中以整合态存在,其整合率为89.7%;HPV-16DNA的表达水平与宫颈鳞癌患者的年龄、有无淋巴结转移无关(P﹥0.05),但在病理分级高的患者中表达高于病理分级低的患者(P﹤0.05),临床分期高的患者中表达高于低分期患者(P﹤0.05);2)基因芯片检测显示在新疆维吾尔族正常宫颈组织及HPV阳性的宫颈鳞癌组织中有64个上调的miRNA,76个下调的miRNA,经RT-PCR方法在组织中验证基因芯片结果显示,在组织中11个表达上调的miRNA的表达与基因芯片结果一致,表达下调的miRNA其中3个与基因芯片结果一致,5个与基因芯片结果相反,基因芯片符合率达73.8%。3)miRNA96、17、196、21、15等在宫颈鳞癌组织的表达水平与患者临床分期、病理分级和间质浸润深度有关(P<0.01),在级别高的肿瘤患者中表达高于级别低的患者,而与患者年龄、肿瘤直径大小和绝经与否均无明显关系(P>0.05)。4)筛选出siHa细胞中丰度下调的15个miRNA,经慢病毒包被后经高通量筛选,筛选出miRNA-1224,Let7c明显抑制肿瘤细胞的增殖。结论:1)HR-HPV感染是导致宫颈癌的主要因素,而HPV-16是新疆维吾尔族宫颈鳞癌主要的病毒类型,其在组织中多以整合态存在,在宫颈癌发病中起主要作用,HPV-DNA整合状态与宫颈细胞的恶性转化密切相关。2)miRNA-196,miRNA-21, miRNA-17、miRNA-15在HPV阳性的宫颈鳞癌组织中表达较正常组织有统计学差异,并与病理分级、间质浸润深度、临床分期相关,可能在宫颈癌的发生与进展中起重要作用,是宫颈癌诊断和预后的潜在标记物。3)miRNA-1224, Let7c在体外细胞系中明显抑制肿瘤细胞的增殖。
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