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拟除虫菊酯类杀虫剂是以天然除虫菊素为先导物仿生合成的一类广谱性杀虫剂,具有光稳定、高效、低毒、药效时间长等优点,被广泛应用于农林害虫、家用卫生及畜禽养殖害虫防治等领域,目前已与有机磷、氨基甲酸酯类农药并称为使用最广的三大农药。拟除虫菊酯为神经毒剂,对鱼类、蜜蜂和家蚕的毒性较高,也是环境和人类健康潜在的威胁物。研究表明拟除虫菊酯经食物链的富集进入人体内可引发急性中毒或蓄积毒性,同时对机体的免疫及心血管系统有明显毒害作用。近年来,拟除虫菊酯类农药在农产品中的残留问题也逐步引起人们的重视,因此研究除虫菊酯类农药新型残留检测技术具有重要意义。本研究利用基因工程技术,对拟除虫菊酯类农药单链可变区抗体进行可溶性表达,建立并优化了拟除虫菊酯类农药多残留酶联免疫分析方法并对其进行初步应用,主要结果如下:(1)成功获得了拟除虫菊酯类农药单链可变区抗体。利用基因工程技术,成功构建两个单链可变区抗体的原核表达载体即pET28a(+)-scFv和pET42a(+)-scFv,经转化至大肠杆菌BL21(DE3)。诱导表达结果显示通过BL21(DE3)/pET28a(+)-scFv获得的单链抗体为无活性包涵体。重组菌BL21(DE3)/pET42a(+)-scFv经0.1mM IPTG,15℃诱导表达15h后可获得部分可溶形式的融合蛋白GST/scFv。此融合蛋白GST/scFv经谷胱甘肽琼脂糖树脂GSTrap FF亲和层析柱纯化,再利用凝血因子Xa 20℃酶切6h去除GST标签后,二次过柱纯化产物经SDS-PAGE和Western blotting检测,可知成功获得条带单一,相对分子质量为28KDa的单链可变区抗体;经间接非竞争酶联免疫检测,该单链可变区抗体的效价为1:2560。(2)建立了适用于氯菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯的IC-ELISA分析方法。以单链可变区抗体和半抗原hap1为基础,并以ODmax和IC50为主要参数,对影响酶联免疫反应的多种因素进行优化,最终确定为:包被抗原(hap1-BSA)以5μg/mL的浓度37℃包被酶标板2h,单链可变区抗体稀释640倍,抗原抗体稀释液为pH7.4,含10%甲醇的PBST缓冲液,竞争时间为80min,HRP/Anti-His酶标二抗稀释7 000倍使用。利用优化后条件建立半抗原hap1对单链抗体的抑制曲线为:I=24.463lgC+42.501,R2=0.9844,IC50为2.03μg/mL,最低检测限IC10为0.046μg/mL,线性检测范围(IC20-IC80)为0.12~34.11μg/mL,对单链抗体进行交叉反应实验,结果显示单链抗体对氯菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯有较强识别作用,抑制中浓度分别为3.29、4.73、5.55μg/mL;对联苯菊酯、氰戊菊酯、氟胺氰菊酯识别较差,对醚菊酯基本无识别能力。利用IC-ELISA对水样中的氯菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯进行添加回收,结果显示在0.5~10μg/mL范围内,三者添加回收率均在82.60~104.01%之间,变异系数在2.71~6.38%之间,表明该单链抗体可用于水样中三种菊酯的检测。(3)利用气相色谱法对比分析IC-ELISA法检测大白菜中氯菊酯的可行性。结果显示:在0.156~5mg/kg的添加浓度下,IC-ELISA回收率为74.68%~82.97%,变异系数为4.13%~11.34%,两种方法的检测结果相关性好,但仍需进一步探索如何消除大白菜基质对分析方法的干扰。