产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是一种重要的人兽共患病的病原体，广泛存在于环境中，极易污染食品及食品原料，并且耐高温不易被杀死，可引起典型的食物中毒和腹泻。在美国，由产气荚膜梭菌引起的食物中毒位居食源性腹泻的第三位。目前国内检测食品中的产气荚膜梭菌仍采用传统的检测方法，操作繁琐、检测时间较长、灵敏度较低，已经不能满足食品中致病菌快速灵敏的检测需要，因此在临床研究和食品安全方面，迫切地需要一种快速、灵敏、特异的方法用于产气荚膜梭菌的早期检测。几年来，细菌检测的新型分子生物学技术陆续被报道，如聚合酶链式反应，比传统的细菌学检测方法高速、特异性强、灵敏度高，但是由于需要昂贵的仪器、繁琐的电泳操作以及较高的专业技术，该方法不适宜在基层应用。本研究建立了一套LAMP技术快速检测产气荚膜梭菌的方法，缩短了检测时间，提高了检测方法的灵敏性。　　 本课题采用环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)检测产气荚膜梭菌，灵敏度高，特异性强，检测方法简便，耗时短且检测成本低。针对产气荚膜梭菌(ATCC13124)GenBank中(基因号AY823400)α毒素全基因保守序列，运用在线引物设计软件(https://primerexplorerjp/lamp3.0.0/index.html)设计LAMP引物。对反应时间、反应温度、镁离子浓度等扩增条件进行优化，确定25μL的LAMP反应体系为：内引物（FIP和BIP）各1.2μmol/L，外引物（F3和B3）各0.2μmol/L，环引物(LF)0.6μmol/L，2.5mmol/LdNTP，1mmol/LMgCl2，10×BstDNA聚合酶反应缓冲液，8U的BstDNA聚合酶大片段，2μLDNA模板和用灭菌双蒸水补足体系。LAMP反应过程是首先在62℃水浴锅中反应20min，然后将其放入80℃水浴锅中，水浴3min终止反应，通过肉眼观察有无白色焦磷酸镁沉淀，即可判断是否发生了LAMP反应。此外，取扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，观察梯形条带，以证实是否发生了LAMP反应。　　 为了比较LAMP检测产气荚膜梭菌的灵敏度和人工污染检出限，以PCR方法作对照。PCR反应的引物是LAMP反应的两条外引物(F3和B3)。结果表明，LAMP检测产气荚膜梭菌的检出限为2.92×102CFU/mL，人工污染产气荚膜梭菌的全脂乳的检出限为15.7CFU/mL。采用试剂盒提取DNA，从样品处理到报告结果，耗时1h。对照PCR耗时3h，检测产气荚膜梭菌的检出限为2.92×105CFU/mL，人工污染产气荚膜梭菌的牛奶的检出限为1.57×105CFU/mL。LAMP的灵敏度是PCR的10000倍。　　 初步研究了5种模板制备方法对LAMP检测产气荚膜梭菌的影响。研究表明LAMP方法对制备模板DNA的要求不高，采用成本廉价热裂解法抽提DNA，可以缩短反应时间，整个反应可在1h内完成，比传统的生化检验方法减少了16～27h。研究表明LAMP将成为可以替代PCR的核酸扩增新技术，为快速检测食源性致病菌构建了一个技术平台。