碱性螺旋-环-螺旋(b HLH)转录因子(TF)是植物最大的基因家族之一,广泛参与植物生长发育的多种生理过程,包括生物和非生物胁迫应答。目前,虽然在一些植物中已经鉴定出了b HLH基因并进行了研究,但主要集中在模式植物;大多数非模式植物,尤其是多年生果树b HLH转录因子所发挥的生理作用以及调控功能仍然不清楚。基于甜橙(Citrus sinensis)全基因组数据库信息,我们在全基因组水平上发掘甜橙b HLH家族基因,筛选低温响应的成员,并对受低温诱导最明显的一个成员Csb HLH18的功能与作用机制进行了研究。得到的主要结果如下:1、从甜橙中共鉴定出56个非冗余的b HLH家族候选基因,分别命名为Csb HLH1-Csb HLH56。除4个成员外,其他的Csb HLHs基因以不同密度不同数量分布于甜橙的9条染色体上。甜橙Csb HLHs分为19个亚家族,相同亚家族成员之间具有类似的基因结构和DNA结合特性。2、对Csb HLHs响应低温处理的表达模式进行分析,结果表明,大多数甜橙b HLH基因会响应冷胁迫,但呈现出不同的表达模式,所有低温响应成员中表达上调最强烈的是Csb HLH18。Csb HLH18全长783 bp,编码260个氨基酸,相对分子质量和等电点分别为28.92 k Da和7.09。Csb HLH18定位于细胞核,并具有转录激活活性且激活结构域位于N端。3、为验证Csb HLH18的抗寒功能,通过农杆菌介导获得了超表达Csb HLH18的烟草与柠檬转基因植株。低温胁迫下,烟草转基因植株生长状态比野生型好,有更高的存活率、光合能力及脯氨酸含量,但活性氧(ROS)含量及电导率降低。同样,柠檬转基因株系在低温处理后叶片萎蔫程度轻于野生型,电导率、MDA(丙二醛)及活性氧含量显著降低,但SOD、POD及CAT三种抗氧化酶活性及基因表达量明显增加。通过RNAi技术获得枳b HLH18被干涉的转基因系,发现干涉系比野生型对低温更敏感,低温处理后干涉系相关生理指标及基因表达的趋势与超表达系相反。4、SOD、POD及CAT三个基因启动子分别有3、8、4个潜在的E-box元件,酵母单杂交发现Csb HLH18只与POD基因启动子上的E-box元件结合,EMSA及双荧光素酶活性检测表明Csb HLH18可以特异结合并激活Cs POD启动子。此外,Csb HLH18与Cs ICE1互作,后者能结合Cs SOD及Cs CAT基因启动子上的E-box元件。上述结果表明Csb HLH18通过直接或间接调控抗氧化酶基因的表达调节ROS稳态,最终在增强植物抗寒性方面发挥功能。5、对低温处理前后的柠檬野生型和超表达系进行RNA-Seq,结果发现低温处理后富集在植株激素信号传导途径的差异基因数量最多且富集程度最显著,同时在淀粉蔗糖合成途径也有一定数量差异基因的富集,说明Csb HLH18增强植物抗寒性的作用机制可能与这些途径相关,但具体的作用方式还需进一步的实验验证。