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目的:骨质疏松症多见且复杂,现有研究表明其病理机制与成骨细胞与破骨细胞相互转化,干细胞向脂肪细胞转化与向成骨细胞转化的失衡等有关。目前已有研究证实中药淫羊藿的提取物淫羊藿苷可作用于成骨细胞、破骨细胞及干细胞,能促进成骨细胞增殖,抑制破骨细胞增殖,促进干细胞成骨分化。但淫羊藿苷在成骨细胞、破骨细胞、干细胞三种细胞耦联状态下的作用机制尚不明确。本研究拟通过体外建立小鼠成骨细胞MC3T3-E1与小鼠破骨细胞(由RANKL诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7分化成)两种细胞的共育体系,以及小鼠成骨细胞MC3T3-E1、小鼠破骨细胞和小鼠BMSCs三种细胞的共育体系,研究淫羊藿苷对成骨-破骨细胞共培养体系中细胞成骨、破骨活性的影响,以及淫羊藿苷干预成骨-破骨-干细胞共培养对干细胞成脂分化的影响。并通过检测人骨骼标本,研究干细胞成脂肪分化相关基因表达与骨质疏松的相关性。方法:1.体外培育小鼠成骨细胞MC3T3-E1和小鼠单核巨噬细胞RAW264.7,RANKL诱导小鼠单核巨噬细胞RAW264.7分化为成熟破骨细胞后,于Transwell小室内建立成骨-破骨细胞共培养体系。通过CCK-8实验、茜素红染色、TRAP染色检测细胞的成骨、破骨活性。采用PCR、Western blot方法检测共培养体系对小鼠成骨细胞MC3T3-E1中OPG、ALP、RANKL、TGF-bl的基因表达以及RANKL的蛋白表达的影响,并检测共培养体系对小鼠破骨细胞中RANK、NF-Kb的基因表达和蛋白表达的影响。2.采用不同浓度淫羊藿苷干预小鼠成骨-破骨细胞共培养体系,以CCK-8法、茜素红染色、TRAP染色检测细胞活性。通过PCR、Western blot方法检测淫羊藿苷对共培养体系中小鼠成骨细胞MC3T3-E1的OPG、ALP、RANKL、TGF-bl的基因表达以及RANKL的蛋白表达的影响,并检测共培养体系对小鼠破骨细胞中RANK、NF-Kb的基因表达和蛋白表达的影响。3.于Transwell小室内建立小鼠成骨细胞MC3T3-E1-破骨细胞-BMSCs共培养体系,之后采用不同浓度淫羊藿苷干预,通过油红O染色检测BMSCs成脂分化情况,通过HE染色检测鉴定直接接触培养的小鼠成骨细胞MC3T3-E1与破骨细胞。采用PCR检测共培养体系中小鼠成骨细胞MC3T3-E1与破骨细胞的OPG、ALP、RANKL、TGF-bl、RANK、NF-κb,以及 BMSCs 的 PPARγ、C/EBPα C/EBPb、RUNX2的基因表达的变化情况。采用Western blot检测OPG、NF-κb,PPARγ的蛋白表达变化情况。4.采用PCR、Western blot方法检测临床患者骨骼标本中PPARγ基因、蛋白表达的变化情况,同患者骨密度等指标做相关性分析。结果:1.小鼠成骨细胞MC3T3-E1和小鼠破骨细胞可在Transwell小室内建立共培养体系;共培养体系影响小鼠成骨细胞与破骨细胞的分化活性,镜下可见成骨细胞分化增多,破骨细胞分化稍减少;表现在成骨细胞相关蛋白OPG、ALP基因表达下降,而TGF-b1、RANKL基因表达上升,破骨细胞相关蛋白RANK、NF-Kb基因表达下降,同时OPG、NF-Kb的蛋白表达亦显示为增强,RANKL的蛋白表达则显示为减弱,均与基因表达变化趋势一致。2.淫羊藿苷可作用于小鼠成骨细胞MC3T3-E1-破骨细胞共培养体系,影响成骨细胞活性,增加OPG、ALP的基因表达,降低TGF-b1、RANKL的基因表达;进一步减弱破骨细胞活性,减少RANK和NF-κb的基因表达,OPG、RANKL、NF-Kb的蛋白表达趋势与基因表达相同,蛋白表达亦显示为减弱。3.可于Transwell小室内建立小鼠成骨细胞MC3T3-E1-破骨细胞-BMSCs共培养体系,共培养体系中小鼠成骨细胞MC3T3-E1成骨活性减弱,OPG、ALP、TGF-b1基因转录水平均下降并且OPG蛋白表达亦减弱,只有RANKL基因转录水平上升;破骨细胞活性增强,NF-κb基因转录水平,蛋白表达水平均减弱,但RANK基因表达明显增强;共培养体系促使BMSCs成脂肪分化,抑制其成骨分化,成脂分化相关的PPARγ、C/EBPα、C/EBPb基因转录水平均上升,PPARy基因蛋白表达亦增强,而与成骨分化相关的RUNX2基因转录水平下降。淫羊藿苷可作用于小鼠成骨细胞MC3T3-E1-破骨细胞-BMSCs共培养体系,增加骨细胞MC3T3-E1成骨活性,表现在OPG、ALP、TGF-b1基因转录水平均上升并且OPG蛋白表达增强,仅有RANKL基因转录水平下降;抑制破骨细胞活性,使得RANK、NF-Kb基因转录水平下降,NF-Kb蛋白表达亦显示为减弱;减弱BMSCs成脂分化水平,抑制其脂质形成面积,降低PPARγ、C/EBPα、C/EBPb基因转录,减弱PPARy的蛋白表达。4.临床患者的PPARγ基因和蛋白表达水平同患者骨密度水平呈负相关性。结论:1.小鼠成骨细胞MC3T3-E1和经RANKL诱导的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7可于体外共培育,并且同时可与小鼠BMSCs共育。2.淫羊藿苷可总体上提高小鼠成骨细胞MC3T3-E1-破骨细胞共育体系的成骨活性,减弱其破骨活性。3.淫羊藿苷作用于小鼠成骨细胞MC3T3-E1-破骨细胞-BMSCs共培养体系可起到促进成骨细胞分化,抑制破骨细胞分化,并抑制BMSCs成脂肪分化的作用。4.临床患者的PPARy基因和蛋白表达水平同骨密度水平呈负相关性。