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目的:传统抗生素的毒副作用及其耐药菌株的出现,迫使人们寻找新型的抗微生物制剂。抗菌肽(Antibacterial peptide,ABP)是由动物、植物、昆虫以及人体基因组编码的具有抗生素样活性的肽类物质。它是机体免疫系统的重要成分,构成宿主防御病原微生物入侵的第一道屏障。抗菌肽除了具有分子量小、热稳定性好、免疫原性较低等特点,还由于其独特的化学结构,能有效抑杀真菌、病毒、细菌、寄生虫,而不易产生耐药性,能选择性杀灭肿瘤细胞,而对人畜毒副作用极小。因此,抗菌肽作为新药开发,具有广阔的前景。蛔虫是寄生于动物和人体内的线虫,从其体内分离到的抗菌肽Ceeropin P1显示有广谱的杀菌作用。本研究以蛔虫抗菌肽Cecropin P1为研究对象,利用基因工程的方法制备蛔虫抗菌肽,并进行了体外抗菌活性测定,为进一步研究其抗菌机理及应用研究打下基础。
方法:根据蛔虫抗菌肽CecropinP1基因序列和氨基酸序列,以及大肠埃希菌对编码同种氨基酸不同密码子的偏嗜性,对蛔虫抗菌肽CecropinP1编码基因进行改造,人工设计并合成了3条抗菌肽CecropinP1基因寡核苷酸片段,通过PCR扩增得到抗菌肽CecropinP1基因,将此基因克隆到原核表达载体pET30a中,然后将重组质粒pET30a-CecropinP1转化大肠杆菌BL21,含有正确重组质粒的阳性菌株经IPTG诱导进行表达,SDS-APGE电泳观察表达产物,琼脂扩散法检测表达产物体外抑菌活性。
结果酶切分析、DNA测序等证实Cecropin P1基因已被正确地插入pET30a中;重组表达质粒pET30a-CecropinP1在大肠杆菌BL21中成功地表达了CecropinP1蛋白;重组蛋白具有一定的抗菌活性。
结论成功构建了重组质粒pMD-18T-CecropinP1与pET-30a-CecropinP1,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中以包涵体形式高效表达,并检测到CecropinP1对部分病原菌的抗菌作用,为进一步研究蛔虫抗菌肽CecropinP1奠定了基础。