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目的:研究黄芪苷IV(AST)对H2O2诱导的H9c2细胞氧化损伤的保护作用及其与P13K/Akt信号通路的关系。
方法:
1.H2O2诱导H9c2细胞氧化损伤模型的建立H9c2细胞常规培养24 h,换用无FBS高糖DMEM培养基并加入不同浓度的H2O2作用3,6,12 h。实验分组:①Control组:加入高糖DMEM培养基；②H2O2100组:加入H2O2终浓度为100μmol/L；③H2O2200组:加入H2O2终浓度为200μmol/L;④H202400组:加入H2O2终浓度为400μmol/L。采用MTT法检测细胞存活率,选择适合的H2O2浓度和作用时间,建立H2O2诱导H9c2细胞损伤模型。
2.AST抗H2O2诱导的H9c2细胞氧化损伤作用及其与P13K/Akt信号通路关系的研究H9c2细胞常规培养24 h,换用无FBS高糖DMEM培养基并加入不同试药。各组加入H2O2后作用6 h。实验分组：①Control组:加入高糖DMEM培养基；②H2O2组:加入终浓度为200μmol/L的H2O2；③AST10+H2O2组:同时加入终浓度为10mg/L的AST和200μmol/L的H2O2；④AST20+H2O2组:同时加入终浓度为20mg/L的AST和200μmol/L的H2O2；⑤LY294002+H2O2组:LY29400210μmol/L预处理10 min,再加入终浓度为200μmol/L的H2O2；⑥LY294002+AST10+H2O2组:LY29400210μmol/L预处理10 min,再同时加入终浓度为10 mg/L的AST和200μmol/L的H2O2；⑦LY294002+AST20+H2O2组:LY29400210μmol/L预处理10min,再同时加入终浓度为20 mg/L的AST和200μmol/L的H2O2。采用MTT法检测细胞存活率；Hochest33258染色、DNA抽提和琼脂糖凝胶电泳、caspase-3活性检测细胞凋亡；Western blot检测H9c2细胞中p-Akt和t-Akt蛋白表达水平。
结果:
1.H2O2诱导H9c2细胞氧化损伤模型的建立H2O2处理3 h,100,200,400μmol/LH2O2组细胞存活率分别为94.6％±4.59,84.7％±15.2,66.3％±14.9；H2O2处理6 h,100,200,400μmol/LH2O2组细胞存活率分别为92.4％±5.33,63.9％±10.1,30.8％±9.83；H2O2处理12 h,100,200,400μmol/LH2O2组细胞存活率分别为69.4％±10.9,24.7％±3.06,24.7％±2.61；与Control组比较,各组细胞存活率均显著降低；其中在H2O2浓度为200μmol/L作用6 h条件下,细胞存活率降低程度适中,适于后续实验。
2.AST对H2O2诱导的H9c2细胞氧化损伤的影响H2O2组,H9c2细胞存活率显著降低；caspase-3活性显著升高；DNA片段弥散程度增强,DNA Ladder明显；Hoechst染色呈致密浓染,细胞核分裂成碎片。
与H2O2组比较,10 mg/L及20 mg/L的AST均能显著提高H9c2细胞存活率；显著降低caspase-3活性；减少Hoechst染色细胞核碎片；减弱DNA片段弥散程度,使DNA Ladder不明显。
3.AST通过P13K/Akt信号通路抗H2O2诱导的H9c2细胞氧化损伤分别与10 mg/L及20 mg/L AST比较,加入P13K/Akt抑制剂LY294002后H9c2细胞存活率显著降低；caspase-3活性明显升高；Hoechst染色呈致密浓染,细胞核碎片增多:DNA片段弥散程度增强,DNA Ladder明显。
Western blot结果显示,10 mg/L及20 mg/L的AST均可显著上调H9c2细胞中p-Akt蛋白表达水平,加入LY294002后P-Akt蛋白的表达被显著抑制。
结论:
1.H2O2诱导H9c2细胞氧化损伤模型建立成功,在H2O2200μmol/L作用6 h的条件下,细胞存活率降低程度适中,适于制备模型。
2.10 mg/L及20 mg/L的AST均可通过提高H9c2细胞存活率,减轻H9c2细胞凋亡发挥抗H2O2诱导的H9c2细胞氧化损伤的作用。
3.AST可上调H202诱导的H9c2细胞中的P-Akt蛋白表达水平,且AST的细胞保护作用可被P13K/Akt抑制剂LY294002阻断,表明AST通过P13K/Akt信号通路抗H202诱导的H9c2细胞氧化损伤。
方法:
1.H2O2诱导H9c2细胞氧化损伤模型的建立H9c2细胞常规培养24 h,换用无FBS高糖DMEM培养基并加入不同浓度的H2O2作用3,6,12 h。实验分组:①Control组:加入高糖DMEM培养基；②H2O2100组:加入H2O2终浓度为100μmol/L；③H2O2200组:加入H2O2终浓度为200μmol/L;④H202400组:加入H2O2终浓度为400μmol/L。采用MTT法检测细胞存活率,选择适合的H2O2浓度和作用时间,建立H2O2诱导H9c2细胞损伤模型。
2.AST抗H2O2诱导的H9c2细胞氧化损伤作用及其与P13K/Akt信号通路关系的研究H9c2细胞常规培养24 h,换用无FBS高糖DMEM培养基并加入不同试药。各组加入H2O2后作用6 h。实验分组：①Control组:加入高糖DMEM培养基；②H2O2组:加入终浓度为200μmol/L的H2O2；③AST10+H2O2组:同时加入终浓度为10mg/L的AST和200μmol/L的H2O2；④AST20+H2O2组:同时加入终浓度为20mg/L的AST和200μmol/L的H2O2；⑤LY294002+H2O2组:LY29400210μmol/L预处理10 min,再加入终浓度为200μmol/L的H2O2；⑥LY294002+AST10+H2O2组:LY29400210μmol/L预处理10 min,再同时加入终浓度为10 mg/L的AST和200μmol/L的H2O2；⑦LY294002+AST20+H2O2组:LY29400210μmol/L预处理10min,再同时加入终浓度为20 mg/L的AST和200μmol/L的H2O2。采用MTT法检测细胞存活率；Hochest33258染色、DNA抽提和琼脂糖凝胶电泳、caspase-3活性检测细胞凋亡；Western blot检测H9c2细胞中p-Akt和t-Akt蛋白表达水平。
结果:
1.H2O2诱导H9c2细胞氧化损伤模型的建立H2O2处理3 h,100,200,400μmol/LH2O2组细胞存活率分别为94.6％±4.59,84.7％±15.2,66.3％±14.9；H2O2处理6 h,100,200,400μmol/LH2O2组细胞存活率分别为92.4％±5.33,63.9％±10.1,30.8％±9.83；H2O2处理12 h,100,200,400μmol/LH2O2组细胞存活率分别为69.4％±10.9,24.7％±3.06,24.7％±2.61；与Control组比较,各组细胞存活率均显著降低；其中在H2O2浓度为200μmol/L作用6 h条件下,细胞存活率降低程度适中,适于后续实验。
2.AST对H2O2诱导的H9c2细胞氧化损伤的影响H2O2组,H9c2细胞存活率显著降低；caspase-3活性显著升高；DNA片段弥散程度增强,DNA Ladder明显；Hoechst染色呈致密浓染,细胞核分裂成碎片。
与H2O2组比较,10 mg/L及20 mg/L的AST均能显著提高H9c2细胞存活率；显著降低caspase-3活性；减少Hoechst染色细胞核碎片；减弱DNA片段弥散程度,使DNA Ladder不明显。
3.AST通过P13K/Akt信号通路抗H2O2诱导的H9c2细胞氧化损伤分别与10 mg/L及20 mg/L AST比较,加入P13K/Akt抑制剂LY294002后H9c2细胞存活率显著降低；caspase-3活性明显升高；Hoechst染色呈致密浓染,细胞核碎片增多:DNA片段弥散程度增强,DNA Ladder明显。
Western blot结果显示,10 mg/L及20 mg/L的AST均可显著上调H9c2细胞中p-Akt蛋白表达水平,加入LY294002后P-Akt蛋白的表达被显著抑制。
结论:
1.H2O2诱导H9c2细胞氧化损伤模型建立成功,在H2O2200μmol/L作用6 h的条件下,细胞存活率降低程度适中,适于制备模型。
2.10 mg/L及20 mg/L的AST均可通过提高H9c2细胞存活率,减轻H9c2细胞凋亡发挥抗H2O2诱导的H9c2细胞氧化损伤的作用。
3.AST可上调H202诱导的H9c2细胞中的P-Akt蛋白表达水平,且AST的细胞保护作用可被P13K/Akt抑制剂LY294002阻断,表明AST通过P13K/Akt信号通路抗H202诱导的H9c2细胞氧化损伤。