本研究围绕胶质瘤干细胞自我更新这一热点领域，探讨mTOR信号通路调控胶质瘤干细胞自我更新和替莫唑胺耐药相关分子机制。 第一部分胶质瘤干细胞分离、体外培养、鉴定和异种肿瘤移植模型 目的：从人脑胶质瘤组织和细胞株中分离脑胶质瘤干细胞、进行体外培养并鉴定其生物学特性，以及制作异种肿瘤移植模型。 方法：采用以CD133免疫磁珠分选技术从人脑胶质瘤组织和细胞系SKMG—4中分离脑胶质瘤干细胞并进行体外无血清培养，通过免疫荧光技术检测分子标志物CD133、Nestin、Sox—2以及谱系分化标志物TuJ1和GFAP；建立裸鼠皮下和脑原位移植模型研究胶质瘤干细胞的致瘤性。 结果：经CD133免疫磁珠分选的CD133+细胞群在胶质瘤干细胞培养液中呈悬浮生长，培养24～48小时，可见肿瘤球，能连续传代并保持较好的增殖生长能力；胶质瘤干细胞培养液培养的CD133-细胞群中大部分细胞呈贴壁生长，未见明显肿瘤球形成，一般无法继续传代培养或仅能传1～2代。免疫荧光染色结果表明，来源于0814、0816、0508和SKMG—4的肿瘤标本经CD133分选后培养的胶质瘤干细胞高表达神经干细胞标记CD133、Nestin和Sox—2，分化谱系标记GFAP和TuJ1表达较低，着色细胞含量均低于10％。CD133和Nestin免疫染色较强的细胞主要分布于肿瘤球表面。不同数量的CD133+胶质瘤干细胞和CD133-胶质瘤细胞注射于BALB/C裸小鼠背侧皮下，胶质瘤干细胞颅内移植后4周，分离取得裸鼠脑组织后行冰冻切片和H&E染色，移植瘤与亲本肿瘤HE染色观察比较，其病理表犁与亲本肿瘤一致。 结论：人脑胶质瘤组织和胶质瘤细胞株中存在的少量CD133+胶质瘤细胞是胶质瘤干细胞。 第二部分 mTOR信号通路调控胶质瘤干细胞自我更新的分子机制研究 目的：研究mTOR信号通路调控胶质瘤干细胞自我更新相关的分子机制 方法：Western blot检测mTOR信号通路组分p—S6K、p—S6和干细胞自我更新相关基因Bmi-1的表达水平；建立mTOR通路干预模型：激活模型和下调模型，肿瘤球形成试验评价干预mTOR信号通路对胶质瘤干细胞自我更新的影响；建立Bmi-1慢病毒shRNA干预模型，肿瘤球生成试验检测Bmi-1基因沉默对胶质瘤干细胞自我更新的影响；免疫荧光检测CD133/GFAP/TuJ1/Bmi-1/水平，评价干预mTOR通路和细胞分化的关系。统计学处理采用SPSS11.0统计分析软件分析。 结果：Western blot蛋白电泳检测结果表明，和CD133-胶质瘤细胞比较，CD133+胶质瘤干细胞表达较高水平的mTOR信号通路组分p—S6K、p—S6和干细胞自我更新相关分子Bmi-1。免疫荧光检测表明，CD133+胶质瘤干细胞高表达p—S6K和Bmi-1，且p—S6高表达的细胞也具有较高的Bmi-1水平。mTOR信号通路激活模型和阻断模型的研究结果表明，过表达Rheb能够激活mTOR信号通路，上调mTOR下游效应器p—S6K和p—S6水平。通过rapamycin作用能够特异性阻断mTOR通路，不减弱AKT和ERK1/2通路。肿瘤球形成试验表明，0814、0816、0508和SKMG—4的胶质瘤干细胞肿瘤球形成率Vector组为138.5±20.5、62.2±8.8、186.2±20.2和115.6±14.8，而Rheb组为180.2±20.8、85.1±9.5、250.5±24.8和149.3±16.5，组间差异均具有统计学意义。通过rapamycin阻断mTOR信号通路，0814、0816、0508和SKMG—4的胶质瘤干细胞肿瘤球形成率对照组为135.2±15.5、62.3±8.2、182.3±20.6和108.6±12.5，rapamycin组为55.5±8.5、20.2±5.8、82.2±10.2和40.6±6.8，自噬抑制剂3-MA组为140.2±18.8、58.1±6.5、175.5±20.8和112.3±12.5，RPA+3-MA组为50.3±8.4、18.1±4.3、75.8±10.8和35.4±5.5。和对照组比较，rapamycin处理显著降低胶质瘤干细胞肿瘤球形成能力，而3-MA处理不能逆转rapamycin的效应，表明rapamycin抑制胶质瘤干细胞自我更新的效应不依赖于自噬。 Western blot检测表明，过表达Rheb和加入IGF-1激活mTOR信号通路能够上调Bmi-1水平。通过rapamycin特异性阻断mTOR通路能够下调Bmi-1水平。Bmi-1基因沉默研究表明，shRNA介导的Bmi-1基因沉默显著降低胶质瘤干细胞肿瘤球形成能力，而导入Rheb基因显著增强胶质瘤干细胞肿瘤球形成能力。通过shRNA下调Rheb过表达细胞中的Bmi-1水平可逆转Rheb的促进效应，在导入Rheb的来源于SKMG—4、0814、0816和0508的胶质瘤干细胞中，scramble组肿瘤球为140.5±16.3、172.2±18.5、85.2±10.6和240.6±25.7，而Bmi-1 shRNA组为42.2±5.8、55.1±7.5、25.5±5.8和80.3±8.5，差异均具有统计学差异。免疫荧光染色结果表明，在来源于SKMG—4、0814、0816和0508的胶质瘤干细胞中，经rapamycin处理后，Bmi-1阳性细胞率由对照组的90.2±5.2％、90.4±6.4％、80.3±4.2％和92.5±5.2％变为35.3±3.4％、28.4±5.2％、10.2±2.4％和45.5±2.5％；TuJ1由对照组的2.1±1.2％、1.4±0.4％、6.3±3.5％和2.5±1.3％变为18.5±5.5％、18.4±6.4％、35.2±8.3％和8.5±3.6％；GFAP由对照组的5.2±1.5％、1.4±0.5％、9.3±4.5％和2.5±5.2％变为25.4±4.2％、5.3±2.4％、45.6±6.2％和10.2±3.7％，组间差异均具有统计学差异。 结论：mTOR信号通路能够调控胶质瘤干细胞自我更新，阻断mTOR通路下调胶质瘤干细胞自我更新潜能，促进其分化。mTOR信号通路对胶质瘤干细胞自我更新的调控作用可能由Bmi-1介导。 第三部分靶向mTOR信号通路逆转替莫唑胺耐药分子机制研究 目的：探讨胶质瘤干细胞对替莫唑胺耐受的分子机制，研究靶向mTOR信号通路逆转替莫唑胺耐药的分子机制。 方法： MTT法检测药物对胶质瘤干细胞的杀伤作用。Western blot检测药物处理前后自噬相关分子Atg5、LC3B和Beclin-1水平；免疫荧光染色检测药物处理后CD133、GFAP、Atg5和active caspase—3水平。电镜观察药物处理后的细胞超微结构变化。裸鼠脑原位移植肿瘤模型研究药物处理对胶质瘤干细胞的致瘤能力影响。统计学处理采用SPSS11.0统计分析软件分析。 结果：免疫荧光技术检测表明，MGMT在来源于SKMG—4的胶质瘤干细胞中高表达，而在来源于0814、0816和0508的胶质瘤干细胞中表达较低。细胞杀伤实验表明，经临床相关浓度替莫唑胺处理后，来源于SKMG—4、0814、0816和0508的CD133-细胞存活率两者比较差异具有显著意义。另外，替莫唑胺对MGMT—胶质瘤干细胞和MGMT+胶质瘤干细胞的杀伤率均低于5％。在来源于SKMG—4、0814、0816和0508的胶质瘤干细胞中，药物联合组和药物单用组比较差异均具有显著意义。免疫荧光染色表明，替莫唑胺对CD133+胶质瘤干细胞作用较弱，而联合rapamycin则能显著减少CD133+细胞比例。免疫荧光分析表明，替莫唑胺处理后，GFAP+细胞出现ATG5染色的自噬体，而CD133+细胞没有变化，表明替莫唑胺主要诱导CD133-细胞产生自噬。Western blot检测结果表明，替莫唑胺单药处理胶质瘤干细胞不能上调自噬相关分子Beclin-1、ATG5和LC3-Ⅱ的表达水平。替莫唑胺联合rapamycin则能引起Beclin-1、ATG5和LC3-Ⅱ水平显著升高。 裸鼠颅内移植肿瘤研究表明，替莫唑胺预处理胶质瘤干细胞不能降低其致瘤潜能，而rapamycin单用或联合替莫唑胺能够显著降低胶质瘤干细胞致瘤潜能。脑原位移植肿瘤切片H&E染色表明，替莫唑胺对胶质瘤干细胞致瘤潜能影响不显著，而替莫唑胺联合rapamycin处理后的胶质瘤干细胞，移植4周后仅在某些移植鼠的大脑形成微小病灶。 结论：胶质瘤干细胞较非胶质瘤干细胞对替莫唑胺较为耐受，MGMT胶质瘤干细胞也可能对替莫唑胺耐受。替莫唑胺主要作用于CD133胶质瘤细胞，诱导其产生自噬。靶向mTOR信号通路能够有效逆转胶质瘤干细胞对替莫唑胺的耐药，降低其致瘤潜能，产生自噬性细胞死亡。 研究小结 1、胶质瘤干细胞中mTOR信号通路组分高表达，该通路能够调控胶质瘤干细胞自我更新。 2、mTOR信号通路调控Bmi-1介导的胶质瘤干细胞自我更新。阻断mTOR通路能够降低胶质瘤干细胞自我更新潜能，促进其分化。 3、靶向mTOR信号通路能够有效逆转胶质瘤干细胞对替莫唑胺的耐药，降低其致瘤潜能，产生自噬性细胞死亡。