磷脂酶D制备及其催化合成磷脂酰丝氨酸研究

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磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)的摄入可以降低脑部功能障碍、预防老年痴呆、治疗脑萎缩、减缓小儿多动症,但天然存在的PS很少,所以,制备PS尤显重要。生物酶法合成PS具有反应条件温和、环境友好、产品质量好等优点。基于此,本论文系统研究了菌株DZQ2a发酵制备磷脂酶D(phospholipase,PLD),并探讨了酶促卵磷脂与L-丝氨酸转磷脂酰反应合成PS的催化性能。首先筛选出可以稳定生产PLD的高产菌株——DZQ2a,经过对富油土壤样本的初筛和复筛,获得的该菌株具有的PLD生产遗传稳定性良好,产酶活5.36U/mL。通过对菌株的形态学特性、遗传学特性及生理生化特性考察,确定该菌株为Ochrobactrum sp.,其同源性与Ochrobactrum intermedium T13可信度高达99%,且生理生化特性完全一致。系统研究了DZQ2a制备PLD的条件及PLD的酶学特性。用正交法优化该发酵过程得到的最优制备条件下,PLD的酶活可达7.35U/mL,各发酵条件对PLD的影响大小依次为:pH>接种量>温度>发酵时间,其中pH、接种量、温度对发酵产酶呈显著影响,发酵时间呈不显著影响。继而使用微滤、盐析、透析、凝胶过滤等方法对发酵液中PLD进行分离纯化,通过对纯化过程中条件的优化,获得单位酶活为83.51U/mg,回收率为12.53%。纯化后的PLD经SDS-PAGE检测,其分子量约为37kDa,并在4oC,pH7.0条件下具有良好的热稳定性及pH稳定性,在40oC、pH7.0条件下PLD活力最高,Na+对PLD酶活具有促进作用。深入研究了在新型溶剂体系(2-甲基四氢呋喃/γ-戊内酯)中,由菌株DZQ2a产的PLD催化制备PS的工艺。酶催化主要受到均相介质组成、底物摩尔比、L-丝氨酸用量、酶用量及反应温度的影响,优化后的催化条件为:2-甲基四氢呋喃/γ戊内酯体积比1:2,L-丝氨酸浓度0.4mmol/L,L-丝氨酸与磷脂酰胆碱比例1:3, PLD酶活106.0U,反应温度40oC。此条件下,PS产率可达81%,具有较高的工业化生产前景。
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