微小隐孢子虫属于寄生性原虫,是一种重要的肠道寄生虫,能够引起人和多种哺乳动物腹泻,甚至死亡,严重威胁人体健康和畜牧业发展,然而目前尚无有效的防治药物。因此,微小隐孢子虫入侵宿主细胞机制的研究对预防和治疗微小隐孢子虫病至关重要。与其他顶复门寄生虫一样,微小隐孢子虫具有典型的分泌型顶端复合体,顶端复合体中含有多种蛋白质,参与虫体入侵宿主细胞过程。研究发现,一些入侵相关的蛋白质为Ⅰ型跨膜蛋白,其定位在虫体头端,如GP900、CpMIC1和TRAP-C1等。硫化肝素是一种糖胺聚糖,可以与弓形虫、恶性疟原虫等顶复门寄生虫结合,抑制它们入侵宿主细胞。研究发现微小隐孢子虫也能与宿主细胞表面的硫化肝素相互作用,并且肝素能抑制微小隐孢子虫入侵宿主细胞。本研究以微小隐孢子虫Ⅰ型跨膜蛋白质Cgd7₂530和Cgd7₄560作为研究对象,通过生物信息学分析,选取特异性好的B细胞表位,设计并合成多肽,通过MBS方法将其偶联到KLH和BSA载体蛋白上;免疫家兔制备抗多肽的抗体,通过亲和层析法纯化多肽特异性IgG。Western blot方法鉴定脱囊后卵囊裂解产物中天然蛋白质的表达;通过间接免疫荧光对蛋白质在子孢子和Ⅰ型裂殖子时期的表达进行亚细胞定位。提取微小隐孢子虫卵囊、子孢子以及体外入侵HCT-8细胞后各个时期的总RNA,通过荧光定量PCR方法,分析Cgd7₂530和Cgd7₄560在虫体入侵不同时期的转录水平。选取Cgd7₂530和Cgd7₄560中亲水性较好的序列构建重组表达载体,表达并纯化重组蛋白质。再通过细胞结合ELISA和流式细胞术检测重组蛋白质与HCT-8细胞的结合情况,然后通过Western blot方法验证重组蛋白质与肝素和硫酸软骨素A的结合情况,最后分析蛋白质中的糖胺聚糖结合基序。通过生物信息学分析,发现微小隐孢子虫Cgd7₂530和Cgd7₄560蛋白质含有N-端信号肽和C-端跨膜区,为Ⅰ型跨膜蛋白质。设计合成了多肽Cgd7₂530⁴⁰⁶NSVNITPFQTEYINE-C⁴²⁰和Cgd7₄560 ²²⁰GFGLSENSRVMEI-C²³²,并制备了多肽抗体。虫体天然蛋白质验证结果显示Cgd7₂530为260kDa,Cgd7₄560为340kDa,与预期结果相同。间接免疫荧光对蛋白质进行亚细胞定位,发现Cgd7₂530和Cgd7₄560都定位在子孢子和Ⅰ型裂殖子的头端。通过荧光定量PCR方法,研究Cgd7₂530和Cgd7₄560基因在各时期的转录水平,结果显示Cgd7₂530在6 h和12 h转录水平最高;Cgd7₄560在12 h转录水平最高。构建了重组表达载体pGEX-Cgd7₂530和pGEX-Cgd7₄560,表达并纯化了重组蛋白质Cgd7₂530-GST和Cgd7₄560-GST。细胞结合ELISA和流式细胞术结果表明Cgd7₂530-GST和Cgd7₄560-GST均能与HCT-8细胞特异性结合,并呈剂量依赖性和可饱和性。肝素结合实验结果显示Cgd7₂530-GST和Cgd7₄560-GST均能与肝素结合,且肝素钠盐能够竞争性抑制这种结合,而硫酸软骨素A则无任何抑制作用。分析Cgd7₂530和Cgd7₄560的氨基酸序列,发现这两种蛋白质均含有糖胺聚糖结合基序,Cgd7₂530含有3个,其中重组蛋白Cgd7₂530-GST包含两个结合基序;Cgd7₄560含有4个,其中重组蛋白Cgd7₄560-GST包含一个结合基序。这些结果表明Cgd7₂530和Cgd7₄560在感染早期高表达,位于微小隐孢子虫顶端复合体,能够与HCT-8细胞结合,并且这种结合可能是由细胞表面的肝素配体介导的,因而这两种蛋白质均可能在虫体入侵过程中发挥重要作用。对微小隐孢子虫肝素结合蛋白研究,有助于进一步阐明微小隐孢子虫入侵的分子基础,并为开发新型抗隐孢子虫制剂提供作用靶点。