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乳腺癌在女性人群中发病率较高,是严重威胁女性身心健康的一大杀手。肿瘤治疗的理论研究一直是人们普遍关注的热点,随着人们对肿瘤发生发展机制认识的加深,肿瘤大治疗方式也逐渐呈现多样化态势,其中就包括乳腺癌。目前乳腺癌的治疗方式主要包括化疗、放疗、靶向治疗及手术切除,但化疗仍是乳腺癌治疗的首选方式。然而化疗的治愈率往往并不理想,资料显示超过一半比例的肿瘤患者在接受化学药物治疗一段时期后会产生对化疗药物的抵抗性,肿瘤细胞对化疗药物的敏感性降低,耐受性增大。这种耐受性还体现在肿瘤细胞不仅对曾使用过的同一化疗药物耐受,对从未使用过的新化疗药物也会产生耐受,这种现象被称为多药耐药(multi-drug resistance,MDR)。因此,研究肿瘤MDR产生的原因及具体机制,有助于指导临床上有效规避由于MDR所致的化疗失败。泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome system,UPS)是人体内重要的蛋白质降解途径,对维持人体各项机能的健全完整具有重要意义。UBE2T(ubiquitin-conjugating enzyme 2T)是一种泛素偶联酶(ubiqintin-conjugating enzyme,E2),在UPS中发挥重要的作用。大量研究证实UBE2T的高表达与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。我们实验室前期研究已证实UBE2T能够促进乳腺癌干细胞的相关特性,且大量研究表明肿瘤干细胞与MDR之间存在密切关系,然而关于UBE2T是否能够调控乳腺癌MDR的研究,目前尚未见诸报道。外排转运体是公认的能引起MDR的机制之一,P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)是存在于细胞膜上的外排转运体,对MDR的产生具有重要作用。本研究将在以上理论背景的支持下,探究UBE2T能否调控乳腺癌的MDR,并进一步了解其调控机制。研究目的探究UBE2T对乳腺癌MDR的调控作用,并初步探索UBE2T调控乳腺癌MDR的分子机制。研究方法1.利用Western blotting检测UBE2T在人乳腺癌细胞系BT549、MDA-MB-231、MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-468 中的基础表达水平;2.根据各细胞系中UBE2T的基础表达水平,选择合适的细胞系,构建UBE2T过表达或沉默细胞系。利用慢病毒感染的手段,将UBE2T基因过表达、UBE2T基因沉默的质粒及其各自对照空载质粒运转入相应的乳腺癌细胞中,随后经嘌呤霉素数次筛选,提取筛选后剩余细胞总蛋白,利用Western blotting验证UBE2T的表达水平;3.利用软琼脂克隆形成实验(Soft agar assay)及微球体形成实验(Sphere formation assay)检测UBE2T对乳腺癌干细胞相关特性的影响;4.利用 MTT 实验(MTT assay)、克隆形成实验(Colony formation assay)和划痕实验(Wound healing assay)检测细胞活力,分析UBE2T对乳腺癌细胞MDR特性的影响;5.利用Western blotting、免疫荧光染色实验检测UBE2T过表达对P-gp表达程度的影响。研究结果1.Western blotting结果显示,UBE2T在MDA-MB-231乳腺癌细胞系中表达程度最高,在SK-BR-3中表达程度最低,在BT549中表达程度略低;2.经Western blotting验证,UBE2T稳定过表达和沉默的乳腺癌细胞系构建成功,结果如下:(1)成功构建UBE2T过表达的乳腺癌细胞系BT549-pLVX-AcGFP-UBE2T及其对照细胞系BT549-pLVX-AcGFP;(2)成功构建沉默UBE2T表达的乳腺癌细胞系MDA-MB-231-pLKO.1-shUBE2T.2、MDA-MB-231-pLKO.1-shUBE2T.3 及其对照细胞系 MDA-MB-231-pLKO.2。3.软琼脂克隆形成实验及微球体形成实验结果显示UBE2T过表达可以显著加强乳腺癌干细胞特性,UBE2T敲低表达可以显著抑制乳腺癌干细胞特性;4.MTT实验结果显示,过表达UBE2T后,抗肿瘤药物在乳腺癌细胞中的半抑制浓度(IC50)显著增高;反之,沉默UBE2T表达后,抗肿瘤药物在乳腺癌细胞中的IC50显著降低;5.克隆形成实验结果显示,在同一抗肿瘤药物相同作用条件下,过表达UBE2T后,乳腺癌细胞克隆的消亡速率显著降低;反之,沉默UBE2T表达后,乳腺癌细胞克隆的消亡速率显著增大;6.划痕实验结果显示,在同一抗肿瘤药物相同作用条件下,过表达UBE2T后,乳腺癌细胞划痕愈合显著增快;反之,沉默UBE2T表达后,乳腺癌细胞划痕愈合显著减慢;7.经Western blotting、免疫荧光染色实验检测UBE2T对乳腺癌细胞系中P-gp表达水平的影响,结果显示过表达UBE2T后,P-gp表达水平增加。研究结论及意义我们的研究发现UBE2T可调控乳腺癌细胞MDR特性,并提示UBE2T是通过调控P-gp的表达进而调控乳腺癌细胞的MDR特性。本研究首次揭示UBE2T与乳腺癌MDR存在一定的相关性,并首次揭示UBE2T对P-gp有调控作用,为临床上逆转乳腺癌MDR现象提供了新思路,为乳腺癌的靶向治疗提供了可能的新靶点。