泛素连接酶Cb1在三氧化二砷诱导肿瘤细胞凋亡或G2/M期阻滞中的作用机制研究目的三氧化二砷（Arsenic trioxide,ATO）是治疗以t（15;17）易位引起的PML/RARα融合蛋白为特征的急性早幼粒细胞白血病（APL）最有效的药物之一。ATO以相对低浓度（≤2μM）即可降解PML/RARα融合蛋白并诱导细胞凋亡。ATO对缺乏PML/RARα融合蛋白的许多肿瘤细胞均有抗癌活性,包括急性髓性白血病,淋巴细胞白血病,多发性骨髓瘤以及实体肿瘤等。然而,由于敏感性或耐药性的不同严重阻碍了临床应用。另外,ATO对大部分的实体肿瘤细胞虽然具有杀伤毒性但是敏感性差,而且大多伴随细胞周期的改变,G1期阻滞或G2/M期阻滞。目前对ATO在APL和实体肿瘤中产生不同作用的机制尚不清楚。Phosphatidylinositol 3-kinase（PI3K）/Akt通路被认为是重要的存活信号通路。在多种肿瘤中研究表明PI3K/Akt的失调控可能造成肿瘤形成,转移和对化疗耐药。组成性的或诱导出的p-Akt介导重要底物分子的磷酸化,改变他们的活性从而启动或抑制凋亡。同时,PI3K/Akt信号通路也受到PTEN和Ras等信号分子的调节。泛素连接酶Casitas B-lineage Lymphoma（Cb1）家族蛋白作为一种PI3K/Akt信号的负调节因子,在一些细胞如T细胞、破骨细胞的功能中起着非常重要的作用。Cb1蛋白能够与PI3K的p85亚单位结合,导致PI3K的泛素化和降解[34,35]而改变信号的传导。然而,Cb1蛋白是否通过调控PI3K/Akt信号参与ATO抗癌作用机制还不清楚。胃癌是当今世界范围内第二位常见的恶性肿瘤。在我国,胃癌是肿瘤死亡的主要原因之一。晚期患者的预后较差,总体疗效不理想。寻找新的合适的药物或合理应用已知药物提高胃癌疗效甚为重要。临床实践证明毒副作用轻、疗效肯定的ATO成为最好的候选药物之一。因此有必要深入研究ATO对APL和胃癌的抗癌作用机制,尤其有必要确定在APL和胃癌中产生差异的确切机制。为深入研究ATO抗癌机制,本实验首先以急性白血病细胞系NB4和HL60为ATO诱导凋亡模型,研究PI3K/Akt信号通路及泛素连接酶Cb1家族蛋白在此过程中的作用。其次以人胃癌细胞系MGC803,BGC823及SGC7901为模型,研究ATO对胃癌细胞的毒性作用,并研究了PI3K/Akt信号通路以及Cb1蛋白在这一过程中的调节机制。最后,进一步探讨了ATO在NB4和MGC803细胞中产生不同作用结果的分子学机制。材料与方法1、采用台盼蓝拒染法和MTT法测定细胞活力。2、采用流式细胞仪通过PI染色进行细胞周期解析及凋亡判定。3、采用Western blot检测Akt、p-Akt、bcl-2、p53、和Cb1-b、c-Cb1蛋白的表达。4、统计学处理:每次实验重复3次,数据以（?）±s表示,采用SPSS13.0软件进行t检验和单因素方差分析。实验结果1、ATO抑制细胞增殖台盼蓝拒染法检测ATO对NB4,HL60细胞活力的影响。ATO以剂量依赖性方式抑制NB4和HL60细胞增殖。抑制细胞增殖50%的药物浓度(IC₅₀)24小时分别1.91μM和4.36μM。MTT法检测ATO对MGC803,BGC823,SGC7901细胞活力的影响。ATO以剂量依赖性方式抑制细胞增殖。抑制细胞增殖50%的药物浓度(IC₅₀)24小时分别23.4μM,25.43μM,27.13μM。提示胃癌细胞对ATO敏感性差。2、ATO诱导NB4,HL60细胞凋亡,诱导胃癌细胞G2/M期阻滞流式细胞仪分析显示ATO分别作用NB4,HL60细胞24小时后,以剂量依赖方式增加细胞凋亡,即亚二倍体细胞百分数（细胞凋亡率）增加。ATO分别处理胃癌MGC803,BGC823,SGC7901细胞24小时后,倒置显微镜下观察,发现细胞仍然保持活力,圆而非帖壁的细胞较对照组多见。进一步以流式细胞仪分析,ATO处理胃癌细胞显示显著的G2/M期阻滞,而亚二倍体细胞无显著增加。提示ATO对胃癌细胞MGC803,BGC823,SGC7901的作用不同于ATO对急性早幼粒细胞白血病NB4细胞。3、ATO对Akt活性的影响分别以ATO诱导细胞凋亡和G2/M期阻滞的代表性浓度作用细胞不同的时间后检测磷酸化Akt（p-Akt）和Akt。Western blot解析结果显示,对照组NB4和HL60细胞均表达一定水平的p-Akt。ATO处理4小时后,二种细胞中均p-Akt显著增加,而后逐渐降至本底水平以下。而Akt水平在ATO作用前后没有变化。对照组胃癌细胞中均表达不同程度的p-Akt。在处理4小时后,也出现p-Akt短暂活化,随后降至本底水平以下。用25μM LN294002预处理细胞抑制PI3K/Akt信号传导。结果显示LY294002显著提高了ATO诱导的细胞凋亡百分比（NB4,HL60）。LY294002显著降低了ATO诱导胃癌细胞的G2/M期阻滞,同时显著提高了的细胞凋亡率（MGC803,BGC823,SGC7901）。进一步分析LY294002对p-Akt的影响,一致地显示LY294002预处理的细胞中ATO诱导的p-Akt的短暂活化消失。提示ATO诱导细胞凋亡和G2/M期阻滞过程中,p-Akt短暂活化为ATO本身的药物特性,并且在ATO抗癌作用中起着重要的调节作用。而p-Akt的最终失活是细胞走向死亡的重要原因。4、ATO对Cb1蛋白表达的影响据报道,Cb1为PI3K/Akt信号通路的负性调节因子。本研究检测了Cb1蛋白的表达及其功能。Western blot解析结果显示,ATO显著增加了NB4,HL60细胞中Cb1-b和c-Cb1蛋白表达,从4小时开始上升,至24小时达到平台。ATO也显著增加了胃癌细胞MGC803,BGC823,SGC7901细胞中Cb1-b和c-Cb1蛋白表达。Ps341能够抑制Cb1蛋白功能。10nMPs341预处理4小时后洗去药物,加入ATO分别处理白血病细胞和胃癌细胞。流式细胞分析结果显示Ps341预处理可部分减少ATO诱导细胞凋亡（NB4,HL60）,而增强ATO诱导胃癌细胞G2/M期阻滞（MGC803,BGC823,SGC7901）。提示Cb1具有重要的调节作用。进一步地,Western blot解析结果显示Ps341预处理本身对细胞的p-Akt基础表达水平没有影响。但是,Ps341预处理显著延长了ATO诱导的PI3K/Akt的活化持续时间。提示Cb1抑制了ATO诱导的p-Akt过度活化。上调Cb1蛋白表达可能为ATO最终抑制PI3K/Akt信号通路,继而使细胞走向死亡的作用机制之一。5、比较ATO诱导NB4细胞凋亡和MGC803细胞G2/M期阻滞过程中,bcl-2蛋白的变化为了研究ATO诱导细胞凋亡和G2/M期阻滞产生不同结果的分子学机制,本实验分析了凋亡早期标志物bcl-2蛋白。分别以1μM和10μM ATO处理NB4细胞和MGC803细胞。在NB4细胞中,bcl-2蛋白从4小时开始下降,至24小时显著低于本底水平。然而,在MGC803细胞中,却没有bcl-2蛋白的下降,至16小时开始出现磷酸化bcl-2。这些结果提示MGC803细胞至少在10μM作用24小时以内没有诱导凋亡与未能下调bcl-2蛋白有关。在MGC803细胞中,bcl-2的磷酸化滞后于G2/M期阻滞的出现,提示bcl-2的磷酸化并不是导致G2/M期阻滞的关键性因子。6、比较ATO诱导凋亡和G2/M期阻滞过程中,p53蛋白的变化NB4细胞和MGC803细胞表达比较高水平的p53蛋白。10μM ATO处理MGC803细胞4小时开始出现p53蛋白表达显著下降。然而,1μM ATO处理NB4细胞后,p53蛋白却没有显著的改变。PI3K/Akt特异性抑制剂LY294002显著增加ATO处理的MGC803细胞中p53蛋白的表达,轻度增加NB4细胞p53表达。提示虽然ATO诱导NB4细胞凋亡没有p53的降解,但是短暂活化的PI3K/Akt信号在两种细胞中均抑制了p53蛋白表达。Ps341预处理进一步减少1ATO处理的胃癌细胞中p53蛋白表达,但是NB4细胞中p53却没有明显变化。进一步,在BGC823,SGC7901细胞中也见到与MGC803细胞中相似现象。提示p53功能的最终状态是使细胞发生凋亡还是G2/M期阻滞的关键因子。结论1、ATO抑制急性白血病细胞和胃癌细胞增殖,但是胃癌细胞敏感性最差。2、ATO诱导NB4,HL60细胞凋亡,胃癌细胞MGC803,BGC823,SGC7901则G2/M期阻滞3、ATO诱导细胞凋亡和G2/M期阻滞过程中均伴随短暂活化PI3K/Akt信号。4、ATO诱导细胞凋亡和G2/M期阻滞过程中均上调Cb1-b和c-Cb1蛋白,Cb1蛋白抑制PI3’K/Akt信号的过度活化5、ATO诱导NB4细胞凋亡时p53蛋白不变,而ATO诱导胃癌细胞G2/M期阻滞时p53蛋白显著下降,p53蛋白最终状态的不同是ATO产生不同结果的决定性因子。