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目的：乙型肝炎病毒是乙性肝炎的病原体，极易引起慢性感染，约50％～75％有活跃的病毒复制和肝脏炎症改变，其中部分可进展为肝硬化、肝功能衰竭或肝癌，最终因此而死亡，严重危害人类健康。拉米夫定为新一代核苷类似物，抑制病毒的复制，降低血清HBVDNA浓度和血清转氨酶水平，是当今较有效的抗病毒治疗药物。但长期用药可引起病毒基因突变，产生耐药变异株，影响疗效。HBV分为A-H8个基因型，基因型分布具有地域性，而且与基因变异、临床症状、临床转归、抗病毒治疗、耐药性等紧密相关。为此，本研究的目的：1.探讨拉米夫定耐药株的变异率、变异类型与基因型的关系；2.建立并分析黑龙江地区的HBV的B基因型、C基因型的流行株的特点；3.对本地区的流行株和拉米夫定耐药株进行全基因序列对比，寻找核苷酸、氨基酸变异的规律，探明耐药的分子机制。
方法：1.对142份慢性乙型肝炎患者血清中HBV采用型特异性巢式PCR(A-F)法进行基因分型。2.采用荧光标记杂交双探针PCR融解曲线法(FH-PCR-MC)检测YMDD变异，并采用统计学方法分析HBV基因型与YMDD变异率及变异类型的差别。3.应用PCR法对8株YMDD野生株和12株YMDD变异株进行全基因扩增，分别构建pMD18T-HBV克隆质粒，并且全基因测序和比较分析各株HBV的基因变异。
结果：1.142例慢性乙型肝炎患者HBV基因分布是：125例HBV属于C基因型，占88％，13例HBV属于B基因型，占9.2％，4例HBV属于D基因型，占2.8％。2.142例标本中，HBV发生YMDD变异有80例占56.3％。在发生YMDD变异的80例患者中，HBV发生YIDD变异34例占42.5％，YVDD变异21例占26.2％，YIDD+YVDD变异18例占22.5％，YMDD+YIDD变异4例5％，YMDD+YVDD变异3例占3.8％。变异的主要类型为YIDD。3.YMDD变异类型分布是：在13例B基因型HBV中，发生YMDD变异的有9例；在125例C基因型HBV中，发生YMDD变异的有68例；在4例D基因型HBV中，发生YMDD变异的有3例。HBVB、C基因型YMDD变异率分别为69.2％，54.4％。二者经统计学处理无显著性差异(P＞0.05)。4.在36例HBV发生YIDD(M+I)的变异株中，B基因型占2例，C基因型占34例；在24例发生YVDD(M+V)的变异株中，B基因型占7例，C基因型占17例。YMDD的变异类型(YVDD与YIDD)在基因型B、C间存在统计学的差异(χ2=4.6，P＜0.05)。D基因型因例数太少，未进行统计学的比较。5.构建8株HBV黑龙江地区流行株的重组质粒(4株HBVB基因型，4株HBVC基因型)，B、C基因型的流行株与分别与其他地区HBVB、C基因型流行株的序列对比，进行系统发生树比较分析。通过对4株B基因型流行株和4株C基因型流行株全基因序列的比较，B、C基因型的流行株同源性小于92％，存在稳定差异共有198个碱基。6.构建12株拉米夫定耐药株的重组质粒(C基因型变异株11株，B基因型变异株1株)，并且进行了全基因测序和分析。(1)11株C基因型变异株全基因测序结果显示：含有rtM204I的变异株6株，其中5株为rtL80I+rtM204I类型的变异，1株为rtL80V+rtL180M+rtM204I类型联合变异。含有rtM204V的变异株5株，其中2株为rtL180M+rtM204V类型的联合变异，3株为rtV173L+rtL180M+rtM204V。(2)1株B基因型变异株的变异类型为rtL180M+rtM204V。(3)12株变异株的变异形式都是联合变异。rtM204I伴随rtL80V/I联合变异发生率为100％，rtM204V伴随rtL180M联合变异发生率为100％。rtV173L的变异只出现rtM204V之中。还有一种新发现类型的联合变异(未见报道)即为rtL80V+rtL180M+rtM204I类型联合变异。(4)C基因型变异株易出现1762、1764位碱基的变异，变异率分别是81.8％，90.9％。C基因型中发生rtM204I的变异株伴随1762、1764位碱基变异的发生率为100％，发生rtM204V的变异株伴随1762位碱基变异的发生率为60％。伴随1764位碱基变异的发生率为80％。B基因型中发生rtM204V变异的变异株不伴随1762、1764位碱基变异。(5)在12株变异株中，有3株发生1896碱基的变异，其中2株是C基因型rtM204I的变异并伴随1762、1764位碱基的变异，一株是B基因型rtM204V的变异。
结论：本研究对142例慢性乙型肝炎患者的HBV进行基因分型、YMDD变异检测及黑龙江地区HBVB、C基因型流行株及拉米夫定B、C基因型耐药株全基因序列分析；发现耐药变异株不仅是YMDD基序变异，还发现其他基因的变异，而且变异与HBV基因型有一定相关性。为深入探讨抗病毒治疗产生耐药机制及有效治疗提供实验基础。