研究背景:耶氏鼠疫杆菌可以通过啮齿动物和跳蚤传播,感染人之后可以引发致死性瘟疫。耶氏鼠疫杆菌可以分泌多种外膜蛋白(Yops)粘附到人上皮细胞上通过多种机制抵抗宿主的免疫应答。其中,YopJ是一个包含288个氨基酸32KD大小的蛋白,它可以阻断细胞因子的产生并诱导感染细胞凋亡。YopJ还是丝氨酸乙酰化酶,可以通过乙酰化IKKβ和MKKs而抑制上述炎症反应。YopJ介导的丝氨酸乙酰化还可以抑制丝氨酸的磷酸化,并进一步阻断MAPK信号和NF- κ B活化,导致炎症因子和抗凋亡细胞因子的释放减少。所以,YopJ介导的丝氨酸乙酰化对宿主的固有免疫应答具有重要影响。赖氨酸乙酰化是我们熟知的一种翻译后修饰形式,它在细胞代谢、RNA修饰、基因表达和线粒体的功能中发挥重要作用。赖氨酸乙酰化酶及赖氨酸去乙酰化酶协同作用精确调控了组蛋白与非组蛋白的乙酰化,进而调控了基因表达、细胞发育和肿瘤发生。但是丝氨酸乙酰化和赖氨酸乙酰化之间的相互作用尚待研究。本研究通过模拟耶氏鼠疫杆菌感染过程揭示细菌性乙酰转移酶YopJ对丝氨酸乙酰化与赖氨酸乙酰化的细胞学效应。应用鸟枪蛋白组学方法和label-free定量技术,我们比较了 YopJ对细胞蛋白上的丝氨酸与赖氨酸残基乙酰化的影响。特别是我们鉴定出了膜相关泛素连接酶MARCH8上的丝氨酸与赖氨酸乙酰化位点并制备了针对MARCH8丝氨酸乙酰化位点的抗体,用免疫学方法证实了 YopJ对March8丝氨酸和赖氨酸乙酰化的影响。YopJ催化区突变体的研究表明YopJ诱导的丝氨酸和赖氨酸乙酰化是催化区依赖的,催化区突变体不能有效诱导丝氨酸和赖氨酸乙酰化。我们的结果表明丝氨酸乙酰化酶YopJ可以靶向其蛋白底物双乙酰化赖氨酸和丝氨酸残基。研究目的:证实YopJ对丝氨酸和赖氨酸残基双乙酰化活性与功能研究方法:1、重组质粒的构建与在HeLa中的表达:YopJ cDNA是全基因合成的,MARCH8 cDNA是通过RT-PCR方法从K562细胞中扩增出来的。MARCH8截断体是1-156aa,全长是1-291aa。cDNAs被亚克隆到pcDNA3. 0-flag载体中,它们的序列都经过测序验证。YopJ催化区突变体C172A是通过定点突变从YopJ重组质粒中扩增而来并经过测序验证。重组质粒经过Omega大抽质粒盒子纯化后用Lipofectamine转染到HeLa细胞中,转染24-48h后收集细胞提取蛋白。2、蛋白提取:收集细胞用PBS洗三遍后,用Millipore RIPA裂解液裂解,通过超声或冰上裂解法获取蛋白。3、溶液内酶解:在一个过滤膜(MicroconYM-30)上,加入50μg的蛋白样品,200 μl含8 M尿素的1 M Tris-HCl中,离心,用50 mM的碳酸氢铵洗两次,用含1 μ g胰酶的50 mM碳酸氢铵重悬,轻轻旋转混匀,37 ℃酶解24h,用C18 Ziptip脱盐后,冻干贮存于-80 ℃备用。4、免疫沉淀和胶内酶解:转染MARCH8和(或)YopJ的HeLa细胞,常规方法制得细胞抽提物,用Flag抗体免疫沉淀带Flag标签的MARCH8,用SDS-PAGE胶分离,手术刀片切下MARCH8条带,标准方法进行胶内酶解24h,过zip-tip脱盐后,LC-MS/MS 分析。5、LC-MS/MS分析:取约2 μ g的肽段注射到C18柱中(200x φ0. 075 mm ),用120 min的线性梯度(5-35%乙腈,0.1%的甲酸水)洗脱,然后用Orbitrap Elite质谱仪检测。数据的采集采用数据依赖模式,所有扫描的一级质谱中前20个最强的峰进行二级质谱测定。MS/MS二级质谱用Mascot和Sequest搜索人蛋白数据库(UniProtKB,88295 entries ),分析软件是 Proteome Discoverer 1.4(Thermo Scientific,San Jose, CA ). MS/MS 质谱图搜库的容差是 0.8 Da,10 ppm,动态修饰是赖氨酸、丝氨酸乙酰化,甲硫氨酸氧化。所有修饰位点的确认需要经过人工检索图谱确定。6、Label-free 定量: Label-free 方法测量肽段的丰度是由 Progenesis LC-MS software (version 4.1; Nonlinear Dynamics, UK)完成的。简言之,质谱获得的Raw文件用ReAdw-program程序转换成mzxml格式,并输入到Progenesis LC-MS软件中。多个分析并行时,离子强度图可用来诊断检测的缺陷。最好的数据集被选作数据校准的参照。排除电荷数为1或>4的肽段。同时搜一个反库(decoy database )来确定出错率(FDR )。每个通过质谱确定的有效肽段的定量定义为该位点的所有肽段丰度之和。统计学分析根据某一位点所有乙酰化肽段丰度之和与未修饰肽段之和的比值。溶液内酶解的数据,有时找不到对应的非乙酰化肽段,就采用某一位点所有乙酰化肽段丰度之和与一套α - actin的参考肽段丰度之和的比值.7、MARCH8 Sac71多克隆抗体的制备:化学合成March8乙酰化肽段Sac71,Ac-T(Sac)ITPSSQDICRICHCEGDC-NH2 及相应的未修饰肽段 S71 ,Ac-TSITPSSQDICRICHCEGDC-NH2,并经质谱验证纯度在90%以上。乙酰化肽段与BSA偶联后,免疫新西兰大白兔三次,末次免疫10天后采血用ELISA法测抗体滴度,末次注射15天后采取所有的血样收集抗血清。抗血清过两次与未修饰肽段偶联的色谱柱去除与未修饰肽段结合部分,再过一次与修饰肽段偶联的色谱柱,收集与修饰肽段结合的成分。抗体的特异性经过Dot-blot和竞争实验验证。8、免疫沉淀-WB:带Flag标签的MARCH8用Flag抗体进行免疫沉淀,沉淀得到的蛋白用SDS-PAGE电泳分离,转移到硝酸纤维素膜上,用5% BSA封闭。一抗用anti-flag、泛赖氨酸乙酰化抗体、MARCH8 Sac71抗体检测。二抗是荧光标记的 IRDye 800CW 或 IRDye 680CW conjugated IgG,结果用 LI-COR 远红外成像系统扫描。9、体外乙酿化实验(用YopJ重组细胞抽提物):转染有MARCH8的HeLa细胞抽提物用Flag抗体进行IP,将MARCH8固定在琼脂糖珠子上,进行体外乙酰化反应。第一份与空载对照pcDNA3. 0-flag的细胞抽提物孵育,第二份与转染YopJ的HeLa细胞抽提物孵育,第三份与转染YopJ突变体C172A的HeLa细胞抽提物孵育。所有体系中都添加乙酰辅酶A,蛋白酶抑制剂,去乙酰化酶抑制剂,在37 ℃孵育1h,孵育结束后,洗涤,用western-blot分析结果。一抗为anti-flag、泛赖氨酸乙酰化抗体(Pan-K)、MARCH8Sac71抗体。MARCH8丝氨酸乙酰化的量与赖氨酸乙酰化的量用Sac71和Pan-K的信号强度来表示。10、体外乙酿化实验(用纯化的YopJ):转染有YopJ或YopJ突变体C172A的HeLa细胞抽提物用Flag抗体进行免疫沉淀,PBS洗涤,0. 2M Glycine (PH=3. 0)洗脱,1M Tris-Cl (PH=8. 5)中和,用TBS透析后作为纯化的YopJ进行体外乙酰化反应。MARCH8细胞抽提物的处理方式与用YopJ重组细胞抽提物相似,只是对照组用TBS代替空载对照。11、体外泛素化反应;E3连接酶MARCH8通过IP方法获得,要有2μg左右,IP结束后,将IP得到的珠子一分为二,一部分为不加E1, E2酶的对照,一部分为泛素化反应管,与包含 rabbit UBE1, UbcH5a (E2), ubiquitin,MG-132。37℃反应适当时间后,加6X凝胶上样缓冲液,SDS-PAGE凝胶电泳,用P4D1及anti-mouse Flag 做一抗进行 western-blotting 检测,Odyssey 远红外成像系统(Li-COR)扫描.并用Odyssey软件定量。12、统计学处理:统计学分析采用SPSS 19. 0软件。P<0. 05或FDR<0. 01为有显著性差异。两组间的统计学分析采用双尾t检验。研究结果:1、乙敢转移酶YopJ介导了 HeLa细胞蛋白丝氨酸和赖氨酸残基的双乙敢化:用鸟枪蛋白组学和Label-free定量,我们证明YopJ的转染可以引起细胞蛋白丝氨酸和赖氨酸乙酰化的提高,其中包括10个丝氨酸乙酰化位点(YopJ/non-YopJ 1. 3-fold, p=0.02)和 8 个赖氨酸乙酰化位点(YopJ/non-YopJ 3.5-fold,p=0. 00003)。2、丝氨酸乙酰化酶YopJ可以双乙酰化E3泛素连接酶MARCH8的丝氨酸和赖氨酸残基:用免疫沉淀和LC-MS/MS证明,YopJ的转染可以双乙酰化MARCH8的S44,S71, S253位点以及K247, K252位点。label-free定量表明YopJ转染的HeLa细胞中 Sac253 和 Sac44 分别提高了 28±11 (p=0. 002)和 31 ±8 (p=0.002)倍,Kac252 和 Kac247 分别提高了 36±18 (p=0.0003)和 18±8 (p=0.01)倍。3、体内外免疫实验均证明乙联化酶YopJ可以双乙酿化MARCH8的丝氨酸和赖氨酸残基:为证实YopJ对MARCH8的双乙酰化作用,我们制备了 MARCH8 Sac71特异性抗体,Dot-blot和竞争实验均证明该抗体是针对Sac71的特异性抗体。IP-WB证实YopJ与MARCH8共转HeLa细胞之后,MARCH8的丝氨酸和赖氨酸乙酰化水平都得到明显提高,丝氨酸乙酰化提高了 1.8倍(1.8±0.5, p=0. 027, n=3),赖氨酸乙酰化提高了 1. 9倍(1. 9±0. 4, p=0. 012, n=3),证明MARCH8中可以在体内提高丝氨酸和赖氨酸乙酰化水平。与此一致的是,共转YopJ的催化区突变体C172A与MARCH8, MARCH8的丝氨酸和赖氨酸乙酰化水平并未得到相应的提高,说明YopJ的双乙酰化作用是催化区依赖的。为进一步证明YopJ是直接乙酰化了MARCH8的赖氨酸和丝氨酸残基,我们又进行了体外试验,首先我们用免疫沉淀得到的MARCH8与转染YopJ的HeLa细胞抽提物及乙酰辅酶A于37 ℃共同孵育lh,然后用MARCH8 Sac71和Pan-K乙酰化抗体分别检测MARCH8的丝氨酸和赖氨酸乙酰化水平,结果与空载对照相比,YopJ可以明显提高MARCH8的丝氨酸和赖氨酸乙酰化水平而其突变体C172A的这种能力明显降低。为进一步排除YopJ细胞抽提物中其他因素的干扰,我们又用纯化的YopJ进行了体外乙酰化实验,结果与用YopJ细胞抽提物得到的结果相似,充分证明了 YopJ对MARCH8丝氨酸和赖氨酸残基的双乙酰化作用。4、YopJ对MARCH8的双乙酰化提高了 MARCH8的自身泛素化水平且这种作用是催化区依赖的:为探讨YopJ对MARCH8的双乙酰化的细胞学或生物学功能,我们检测了 MARCH8的自身泛素化水平。结果表明,与YopJ共转的MARCH8的体外自身泛素化水平比单转MARCH8的明显提高,YopJ突变体C172A提高MARCH8自身泛素化水平的能力明显降低,说明这一能力是催化区依赖的。结论:我们通过鸟枪蛋白组学和Label-free方法证明了丝氨酸乙酰化酶YopJ对细胞蛋白水平和靶蛋白MARCH8丝氨酸和赖氨酸残基的双乙酰化,并用免疫学方法用体内外实验证明了 YopJ对MARCH8的双乙酰化,提示丝氨酸乙酰化和赖氨酸乙酰化之间可能构成网络。特别是,YopJ的双乙酰化参与了 MARCH8的自身泛素化过程,提示了 MARCH8双乙酰化对自身泛素化的调控作用。一般来说组蛋白乙酰化是在核小体突出的N-末端的赖氨酸残基上添加乙酰基团,组蛋白乙酰化在染色体的结构与功能与染色体重塑中发挥重要作用。乙酰化也可能发生在除赖氨酸之外的其他残基上,但是尚未有蛋白组水平的深入研究。本研究报道了一种宽容差乙酰化分析方法,它用液相串联质谱的鸟枪蛋白组学方法获取数据再用非特定氨基酸上添加42 ± 0.5 Da delta mass搜库。用宽容差结合MoDa搜库法我们从肾组织的组蛋白上发现了 K,S和T残基上的42±0.5 Da delta mass。精确的delta mass分析鉴定出42.011 ±0.004 Da的乙酰化修饰和42.047±0.002 Da的三甲基化修饰。我们制备了特异性的H3T22ac乙酰化抗体,用免疫学方法证实了组蛋白H3上T22位点的乙酰化修饰。因此,我们证实了宽容差乙酰化分析可以鉴定出组蛋白上除赖氨酸之外的非特定氨基酸上的乙酰化相关修饰。