研究背景及目的卵巢癌是最常见的妇科肿瘤之一,其致死率占各类妇科肿瘤的首位。国际癌症研究机构的数据显示,估计2008年的新发病率为6.3/10万,死亡率为3.8/10万。我国肿瘤登记地区资料表明,2009年我国卵巢癌的新发病率为7.95/10万,死亡率为3.44/10万。由于卵巢癌的早期症状很不明显,诊断延误导致确诊时约70%的卵巢癌已属晚期。卵巢癌早期预后极好,但晚期只有10-30%的存活率。因此,迫切需要一些敏感性好、特异性高的肿瘤标志物用于卵巢癌的早期诊断。目前卵巢癌常规诊断主要是检测生物标志物癌抗原-125(CA125)。CA125是从非黏性卵巢癌细胞表面分泌到血液中的一种糖蛋白,分子量200kD,是上皮性卵巢癌和子宫内膜癌的标志物。CA125升高还可见于胰腺癌、肺癌及其他妇科肿瘤,是一种广谱的肿瘤标记物。虽然80%以上的上皮性卵巢癌CA125在血清浓度会升高,但对于早期卵巢癌的诊断敏感性、特异性比较低。因此,CA125不能作为诊断卵巢癌的唯一指标,它需要另一种肿瘤标志物替代它或一起实现联合诊断。人附睾分泌蛋白4(HE4)是一种新的、有潜力的卵巢癌标志物,在卵巢癌的早期诊断及疾病监测方面具有良好的应用前景。HE4属于乳清酸性4-二硫化中心(WFDC)蛋白家族。其基因定位在染色体20q12—q13.1,全长11.78kb,由5个外显子和4个内含子组成,编码小分子蛋白,有高度保守的两个“乳清酸性蛋白(whey acidic proteins,WAP)域”和一个“4-二硫化中心”,其中的小分子分泌型蛋白与细胞外蛋白酶抑制剂有极高的同源性。HE4基因编码蛋白的分子量为13KD,而成熟糖化后的HE4蛋白是含有2个WFDC结构域的单肽,分子量约20-25KD。国内外学者对HE4研究表明,正常生理情况下,HE4在人体的表达水平非常低,但在卵巢癌组织和患者血清中均高表达。Hellstrom指出,在卵巢癌血清中,HE4与CA125的敏感性相似,但在恶性肿瘤与妇科良性疾病的血清中,HE4的特异性远高于CA125。而日益增多的研究证据表明,HE4在卵巢癌的早期诊断及疾病监测方面具有良好的应用前景。此外,有文献指出,CA125和HE4相结合预测卵巢恶性肿瘤比单指标预测更加准确,当CA125联合HE4用于检测恶性肿瘤,敏感性为76.4%,特异性为95%,大大高于单个指标检测。标记免疫分析,是一门将多种标记示踪技术的高度灵敏性和免疫学抗原抗体反应的高度特异性相结合进行分析测定,集基础医学、实验技术和临床应用于一体的学科。标记免疫分析包括放射免疫分析(RIA)及非放射免疫分析,后者包括荧光免疫分析(FIA)、胶体金免疫分析(GICA)、酶免疫分析(EIA)、化学发光免疫分析(CLIA)、时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)等。时间分辨荧光免疫分析(Timed-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)是一种灵敏的高端定量免疫检测技术,是以镧系稀土离子作为标记物来标记抗原或抗体,因镧系稀土离子具有独特的荧光特性,该技术能够获得极高的信噪比,从而具有很高的灵敏度(10-18mol/孔),且具有标记物制备简便、储存时间长、无放射性污染、检测重复性好、标准曲线范围宽、操作流程短、易自动化、不受样品自然荧光干扰、多标记和应用范围十分广泛等优点。时间分辨荧光免疫分析相对于酶免分析、放射免疫分析有更高的临床应用价值。TRFIA技术适用于各种抗原抗体的临床检测,在市场上已得到广泛应用。本研究采用时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)技术研制HE4定量检测试剂、HE4与CA125双标记定量检测试剂,通过检测各项性能指标,并与其它检测试剂盒进行比较,评价其在临床检测应用中的可行性。方法：(一)采用双抗体夹心法研制血清人附睾分泌蛋白-4(HE4)时间分辨免疫荧光分析检测试剂。1.用HE4抗原配制定标品及质控品定标品浓度：20pmol/L、200pmol/L、500pmol/L、1000pmol/L;质控品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ浓度分别为：30pmol/L、90pmol/L和270pmol/L。每瓶1ml分装冻干,4℃保存备用。2.用包被液将HE4包被抗体稀释至3ug/ml,加入96微孔板中包被,37℃震荡2小时后,4℃过夜,37℃封闭3小时,真空抽干,4℃保存。3.Eu3+标记抗体制备超滤管纯化抗体后,按质量比5：1与铕标记试剂充分混匀,25℃振荡过夜,次日过SephadexTM G-50凝胶层析柱纯化,同时收集流出液(1ml/管),逐管测荧光值,合并峰管,加入10%浓度的BSA作保护剂,—20℃保存。4.原料筛选不同抗体进行配对筛选评估,选择阳性荧光值较高、阴性本底较低、线性好、灵敏度高、特异性高、信噪比高、临床血样测值准确的一对为HE4试剂原料。5.采用棋盘滴定法对6F8包被抗体的包被浓度及H5的铕标记抗体的最佳稀释度进行确定。选择阳性荧光值较高、阴性本底较低,信噪比高的为最佳包被量及稀释度。6.参考值范围：以自制的HE4-TRFIA试剂检测451份女性健康人血清,统计血清HE4抗原水平的分布情况,计算样本荧光值与阴性对照的比值。取比值的平均值,以比值均值加两个标准差,初步确定为试剂盒的正常人参考值,再综合其他文献研究资料及临床现行参考值范围,最终确定参考值范围。7.试剂性能指标的评价7.1绘制剂量-反应曲线：以自配的参考标准品浓度的对数为自变量(X),以信号值1×103计数的对数为因变量(Y),用双对数数学模型Log-Log函数处理。7.2线性范围及分析灵敏度：重复测定零定标品(A)10次,计算其均值(X)及标准差(SD)。以X+2SD所得信号值代入剂量-反应曲线求出浓度值,为该试剂盒的最低检出量,即分析灵敏度。7.3Hook效应：配制浓度递增的多个参考标准品抗原,并对其进行测定。7.4准确度实验：使用阴性血清将HE4抗原系列倍比稀释作为样品,在自制试剂盒上测定,各设3个复孔,计算不同稀释度条件下理论浓度及实测浓度的比值,即稀释回收率。7.5精密度实验：重复测定质控品Ⅰ、 Ⅱ、Ⅲ,得到各质控品检测值的均数、标准差及变异系数(CV)。7.6特异性实验：将一定浓度的干扰物质用本试剂盒检测,得到的相应浓度与该类物质的量的比值的百分率,为交叉反应率。7.7抗干扰性分析：质控Ⅰ、Ⅲ中加入一定量的甘油三酯、血红蛋白和胆红素,并对其进行测定,判断干扰情况。7.8稳定性：37℃放置7天,评价其线性、精密性等指标。8.与国外试剂的比较实验：样本用自制试剂与对照试剂检测后,将所测浓度值进行相关性分析。(二)采用双抗体夹心法研制人附睾蛋白4(HE4)及癌抗原-125(CA125)双标记定量检测时间分辨荧光免疫分析试剂。1.用HE4抗原、CA125抗原配制定标品及质控品,定标品浓度：Opmol/L/OU/mL、20pmol/L/28.4U/mL、50pmol/L/53U/mL、200pmol/L/500pmol/L/445.9U/mL、1000pmol/L/815U/mL,质控品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ浓度为：35pmol/L/16U/mL、110pmol/L/41U/mL和350pmol/L/265U/mL每瓶1ml分装冻干,4℃保存备用。2.固相包被抗体用包被液将HE4包被抗体6F8、CA125包被抗体M5807稀释后,一同加入96微孔板中包被,37℃震荡2小时后,4℃过夜,37℃封闭3小时,真空抽干,4℃保存。3.Eu3十标记抗体制备超滤管纯化抗体后,按质量比5：1与铕标记试剂充分混匀,25℃振荡过夜,次日过SephadexTM G-50凝胶层析柱纯化,同时收集流出液(1ml/管),逐管测量吸光度,合并峰管,加10%BSA保护剂,—20℃保存。4.Sm3+标记抗体制备超滤管纯化抗体后,按质量比2：1与铕标记试剂充分混匀,25℃振荡过夜,次日过SephadexTM G-50凝胶层析柱纯化,同时收集流出液(1ml/管),逐管测量吸光度,合并峰管,加入10%浓度的BSA作保护剂,—20℃保存。5.比较HE4及CA125不同标记的荧光值及临床血样测值,确定反应条件。6.采用棋盘滴定法对M5807包被抗体的包被浓度及M5814的铕标记抗体的最佳稀释度进行确定。选择阳性荧光值较高、阴性本底较低,信噪比高的为最佳包被量及稀释度。7.对加样体积(25μL、30μL、35μL、40μL、50μL)进行优化。8.试剂性能指标的评价8.1绘制剂量-反应曲线：以自配的参考标准品浓度的对数为自变量(X),以信号值1×103计数的对数为因变量(Y),用双对数数学模型Log-Log函数处理,分别绘制HE4-TRFIA和CA125-TRFIA剂量-反应曲线。8.2线性范围、分析灵敏度及Hook效应：重复测定零定标品(A)20次,分别计算HE4和CA125的均值(X)及标准差(SD)。以均值X+2SD所得信号值代入剂量-反应曲线求出浓度值,计算出HE4-TRFIA和CA125-TRFIA的分析灵敏度。测定多个浓度递增的参考标准品。8.3准确度实验：使用阴性血清将HE4抗原和CA125抗原同时倍比稀释作为样品,在自制试剂盒上测定,各设3个复孔,计算不同稀释度条件下理论浓度及实测浓度的比值,即稀释回收率。8.4精密度实验：重复测定质控品Ⅰ,Ⅱ、Ⅲ,得到各质控品检测值的均数、标准差及变异系数(CV)。8.5特异性实验：用HE4/CA125-TRFIA试剂盒测定一定浓度的干扰物质,计算得到的相应浓度与该类物质的量的比值的百分率,为交叉反应率。8.6抗干扰性分析：质控Ⅰ、Ⅲ中加入一定量的甘油三酯、血红蛋白和胆红素,并对其进行测定,判断干扰情况。8.7稳定性：37℃放置7天,检测试剂盒各项性能指标。9.与国外试剂的比较实验：样本用自制试剂与对照试剂检测后将所测浓度值进行相关性分析。结果：(一)采用双抗体夹心法研制人附睾蛋白4(HE4)定量检测时间分辨荧光免疫分析试剂。抗体配对筛选确定6F8为包被抗体及H5为标记抗体,棋盘滴定法确定6F8按3ug/ml包被、H5-Eu3+的稀释比例为1：200。451份相对健康女性血清测试结果,t检验结果表明50岁以上的HE4水平显著高于50岁以下；当浓度值在≤90pmol/L时,包含了96.9%的样本；ROC曲线表明,当浓度值在90pmol/L时,敏感性为75%,特异性为96.1%；据此设定本试剂盒检测时的人血清HE4浓度的cut-off值为90pmol/L。计算得出试剂盒的最低检出量为0.73pmol/L,测量范围为0.73-1000pmol/L,线性范围内,剂量-反应曲线线性相关系数,r=0.9996,当浓度值大于2000pmol/L时,所测荧光值线性出现偏差,曲线出现HOOK效应。本试剂稀释回收率在90%-113%之间。分析内和分析间的精密度分别为4.6%-7.5%和8.3%-14.4%。与CA153、CEA、AFP、HBsAg、CA125、CA19-9、 CA50和HCG无交叉反应。本试剂不受血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰。试剂盒放置于37℃7天,各项性能指标均符合要求,稳定性较好。将本试剂与罗氏试剂做相关分析,分别对133例血清样本进行检测,评价两种试剂之间的检测相关性,相关性方程为y=0.794x+12.255,R2为0.976,P<0.001,说明本试剂能够很好的满足临床检测的要求。.(二)采用双抗体夹心法研制人附睾蛋白4(HE4)和癌抗原-125(CA125)双标记定量检测时间分辨荧光免疫分析试剂。根据荧光值计数及临床血样测值,确定HE4标记抗体H5用Eu3+标记,CA125标记抗体M5814用Sm3+标记,棋盘滴定法确定CA125包被抗体M5807按3ug/ml包被、M5814-Sm3+的稀释比例为1：50。HE4试剂最低检出量为0.476pmol/L,测量范围为0.476-1000pmol/L;线性范围内,HE4剂量-反应曲线线性相关系数,r=0.9994；稀释回收率在93.5%-107.3%之间。HE4试剂分析内和分析间的精密度分别为3.02%-8.81%和0.65%-8.57%。HE4试剂与CA153、AFP、CEA、HBsAg、CA19-9、CA50、hCG无交叉反应。HE4试剂不受血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰。试剂盒放置于37℃7天,各项性能指标均符合要求,稳定性较好。将本试剂与罗氏试剂做相关分析,对147例血清样本进行检测,评价两种试剂之间HE4的检测相关性,相关性方程为y=0.9756x-0.1956,R2为0.905,P<0.001,说明本试剂能够很好的满足临床检测的要求。CA125试剂最低检出量为1.6U/mL,测量范围为1.6-815U/mL；线性范围内,CA125剂量-反应曲线线性相关系数,r=1.0000；稀释回收率在97.9%-105%之间。CA125试剂分析内和分析间的精密度分别为2.60%-9.27%和5.24%-7.88%。CA125试剂与CA153、AFP、CEA、HBsAg、CA19-9、CA50、 hCG无交叉反应。CA125试剂不受血红蛋白、甘油三酯、胆红素的干扰。试剂盒放置于37℃7天,各项性能指标均符合要求,稳定性较好。将本试剂与罗氏试剂做相关分析,对153例血清样本进行检测,评价两种试剂之间CA125的检测相关性,相关性方程为y=0.9953x-10.070,R2为0.986,P<0.001,说明本试剂能够很好的满足临床检测的要求。结论：上述结果表明本研究研制的人附睾蛋白4(HE4)定量检测时间分辨荧光免疫分析试剂、HE4和CA125双标记时间分辨荧光免疫分析定量检测试剂的各项指标(准确度、灵敏度、精密度、特异性等)均满足体外诊断试剂的注册要求,与进口产品性能相近,有望经进一步优化后应用于生产。